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《西南大学》 2010年
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桑椹中白藜芦醇及其苷的含量和光稳定性研究及MaPAL基因的克隆分析

赵康  
【摘要】: 桑椹是食药两用的水果,是中医药中的常用滋补药材,具有生津止渴、滋阴补血、补肝益肾、固精安胎、乌须黑发、聪耳明目、安神养心、润肠通便、健步履、利关节、祛风湿、解酒等功效,常用于治疗糖尿病、肝肾阴虚、失眠耳鸣、津液不足、风湿、便秘、须发早白、神经衰弱等症状。桑椹的药用物质基础之一是其中的白藜芦醇及其苷。白藜芦醇及其苷具有显著的抗癌抑癌、保护心血管、抗氧化和抗自由基、保护神经、抗炎、抗细菌和真菌、拮抗内皮素的作用,并显示雌激素样活性,影响骨代谢。 桑椹是富含白藜芦醇的食物,但迄今对桑椹中的白藜芦醇及其苷的研究尚少。为了确定桑椹的最佳采收期,筛选白藜芦醇总含量更高的桑椹品种,为市场提供保健功能更佳的桑椹,本实验研究了桑椹成熟过程中白藜芦醇及其苷的含量变化,比较了不同品种桑椹中白藜芦醇及其苷的含量,并研究了桑椹汁中白藜芦醇及其苷的光稳定性。 本文以重庆西里蚕种厂所产桑椹为材料,建立了同时测定桑椹中白藜芦醇及其苷含量的RP-HPLC方法,色谱柱为phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,4μm),以甲醇-水为流动相梯度洗脱,检测波长305 nm,流速0.8 mL/min。对该方法进行了方法学评价,结果显示:该方法测定桑椹中白藜芦醇及其苷含量的专属性强;分别在0.5~50μg/ml和2~100μg/mL进样浓度范围线性关系良好;仪器精密度和日内精密度均良好,RSD4%;准确度良好,加样回收率95%-105%之间;重复性良好,RSD1.5%。采用该含量测定方法测定了红果2号成熟过程中白藜芦醇及其苷的含量变化,并比较了红果2号、红果1号、西农1号、嘉陵30号1系、嘉陵30号2系等五个果桑品系的成熟桑椹的白藜芦醇及其苷含量。结果显示,在桑椹发育全程中白藜芦醇苷的含量始终高于白藜芦醇,它们在桑椹中的含量均为红果中期最高,紫果时下降;五个桑椹品种中,西农1号红果的总白藜芦醇含量最高,达94.5μg/g。确定桑椹的最佳采摘期为红果刚转紫时。 本文还考察了与桑椹汁或花色苷溶液混合的反式白藜芦醇及其苷对紫外光的稳定性,以反式白藜芦醇及其苷转化为顺式的百分率为稳定性评价指标,发现在低浓度花色苷存在时,反式白藜芦醇及其苷的异构转化率更高,提示反式白藜芦醇及其苷在紫外线下的反应活性较花色苷更高;而高浓度的花色苷可抑制紫外线引起的反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷的变构作用,其原因可能是高浓度的花色苷可吸收大部分紫外光,使实际到达白藜芦醇及其苷分子的紫外光强度大大降低,从而保护反式白藜芦醇及其苷,降低它们转化为顺式异构体的百分率。加入桑椹汁后,反式白藜芦醇及其苷在紫外光下的稳定性增强,其原因也可能是桑椹汁中大量的花色苷对白藜芦醇及其苷有保护作用。 克隆了桑中苯丙氨酸氨基裂解酶的基因MaPAL的cDNA序列。该基因cDNA全长为含有一个2181 bp的开放阅读框(ORF),能够编码含有726个氨基酸残基的蛋白;该蛋白分子量为78.49 kDa,预测等电点(pI)8.2,分子式是C_(3453)H_(5530)N_(956)O_(1074)S_(27);分布在叶绿体或类囊体中。本文还对MaPAL翻译出的氨基酸序列进行同源性分析,发现该蛋白在核心区的保守性较高,但在两端的同源性较低。该蛋白明显存在裸子植物和被子植物的区别,说明该蛋白在被子植物和裸子植物分化之前就已经存在,编码该蛋白的是一个古老的基因。
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