胆固醇氧化酶产生菌Enterobacter sp.的筛选及其酶分离纯化的研究

【摘要】： 胆固醇是机体内重要的固醇类物质,它具有多种多样的生理功能,但是体内过多的胆固醇却是引起冠心病、动脉硬化和心肌梗塞的危险因素之一。胆固醇氧化酶(COD,EC 1.1.3.6)是一类黄素蛋白,属于GMC氧化还原酶体系,它能催化胆固醇分解成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢,是胆固醇代谢过程中的第一个酶,也是一个关键酶,它能够快速准确地检测出血清中胆固醇的浓度,用来诊断动脉硬化和其他脂质紊乱疾病;能够降低食品中的胆固醇含量,有益于人类健康;能够有效地杀灭鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目和同翅目的害虫,是一种安全有效的生物杀虫剂;此外,胆固醇氧化酶氧化胆固醇生成的胆甾-4-烯-3-酮在治疗肥胖等方面具有应用前景。 本研究的目的是获得大量来源的胆固醇氧化酶,以满足工业和医疗领域的需要,从不同的环境中筛选得到了14株高产胞外胆固醇氧化酶(COD)的菌株,其中胆固醇氧化酶活性最高的一株菌,命名为COX8-9,通过菌体形态,菌落特征,生理生化反应和16SrDNA基因全序列分析,初步鉴定该菌属于肠杆菌属(Enterobacter)。 利用单因子实验和正交实验对菌株COX8-9产胆固醇氧化酶摇瓶发酵的培养基及培养条件进行优化。结果表明,发酵培养基的最佳成份为:胆固醇0.2%,酵母粉0.5%,可溶性淀粉0.5%,CuSO4·5H2O 0.001%,吐温-80 0.3%, NH4NO30.1%,KH2PO40.025%,MgSO4·7H2O 0.025%, FeSO40.0001%,pH 7.0 ,最适培养条件为接种量5%,种龄15h~18h,摇瓶装量为30mL培养基/250mL三角瓶,30℃,200r/min,发酵48 h,胆固醇氧化酶活力可达到748U/L。 菌株COX8-9的发酵上清液经过超滤后,连续两次通过不同pH值的Q-sepharose柱,再过superdex-75凝胶过滤色谱,得到了纯化的胆固醇氧化酶。纯化的胆固醇氧化酶是分子量为58 kDa的单体酶,在280nm处有最大吸收峰。该酶氧化胆固醇的Km值为1.19×10-4 mol/L,最适温度为25℃,在40℃以下都比较稳定;最适pH为7.0,而在pH9.0时最稳定;金属离子Cu2+可以提高胆固醇氧化酶的活力,可将其提高三倍;在30℃温度下,该酶在长期的水溶液储存条件下都比较稳定,表明了该酶作为临床诊断试剂的潜力。其他筛选菌株的胆固醇氧化酶的鉴定及制备工作正在进行中。