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《四川师范大学》 2009年
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引起肿瘤细胞自噬的小分子化合物的发现及其机制研究

韩伟  
【摘要】: 自噬是发生在真核细胞中由细胞初级溶酶体处理内源性底物的重要生理过程,生命体借此维持蛋白质代谢平衡及细胞内环境稳定。自噬不仅对细胞清除废物、重建结构以及生长发育起重要作用,还与肿瘤的发生、发展密切相关。发现促进细胞自噬的小分子抗肿瘤化合物,为抗肿瘤药物研究提供一定依据。 本文成功建立了在HCT-116细胞上自噬筛选的模型。选择HCT-116、HeLa等细胞转染pGFP-LC3质粒,转染后加入新霉素抗性维持培养至被转染的目的基因稳定整合到细胞的基因组中,形成单细胞克隆,挑选出带有荧光的细胞克隆,用化合物长春碱检测细胞内自噬发生的程度,荧光显微镜观察GFP标记的LC3在细胞内的定位分布变化:由胞浆内弥散分布变为呈点状分布于自噬泡的周围,同时western blot检测LC3条带的变化:由LC3I变为LC3II。 利用上述模型,从化合物库里100多个具有抗肿瘤活性的化合物中挑选出28个在HCT-116细胞上的IC50在5.5μg/ml以下的化合物,以3倍IC50、9倍IC50的化合物浓度与HCT-116细胞孵育24 h,收集细胞样品进行western bolt检测。初筛得到11个有明显自噬活性的化合物,复筛得到6个有明显自噬活性的化合物,选择化合物physalinB进行作用机制方面的研究。 physalinB在多种细胞里有抗肿瘤活性。MTT法检测了其在HCT-116细胞中的抗肿瘤活性,Western blot检测其诱导HCT-116细胞的自噬具有明显的时间、浓度依赖性,荧光显微镜观察其引起了HCT-116稳定细胞株内绿色荧光呈点状分布于自噬泡的周围。Western blot检测到自噬信号通路相关蛋白AKT的磷酸化蛋白表达量降低、ERK的磷酸化蛋白表达量增加及mTOR的磷酸化蛋白表达量降低,蛋白质Beclin-1的表达量并没有增加,而且该化合物所引起的自噬不能被经典的自噬的抑制剂3-MA所阻断,可以被ERK的抑制剂PD98059部分反转,同时检测到凋亡早期蛋白PARP的剪切并能被caspase的抑制剂Z-VAD-FMK完全反转。 该化合物引起自噬的信号通路是I型的PI3K依赖的,而不是III型PI3K依赖的。
【学位授予单位】:四川师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R730.2

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