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小麦叶片胞间液蛋白的分离分析研究

白婷  
【摘要】: 植物细胞间隙液蛋白在植物的生长发育、抗病抗逆反应等各种生物学过程中具有十分重要的作用,由于植物中的细胞间隙液蛋白质含量低,而且细胞膜容易破损,所以其提取与分离工作难以有效开展。本文旨在建立一种有效的适合小麦叶片细胞间隙液蛋白质的提取方法,并运用蛋白质组学的多种研究方法对小麦叶片细胞间隙液蛋白质进行分离,为开展小麦叶片细胞间隙液蛋白质在小麦生长发育、抗病抗逆等方面的研究提供了新的研究方式。 首先,本文筛选优化出了较为合适的小麦叶片细胞间隙液蛋白质的提取方法。结果显示:以50mM NaAC作为提取缓冲液,负压处理小麦叶片20 min,以40×g离心5 min除去提取缓冲液后,再以2000×g离心15 min收集细胞间隙液,可以得到较好的提取效果。收集细胞间隙液,冷冻干燥后,以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并分离小麦叶片细胞间隙液的蛋白质。把SDS-PAGE分离所得的44条细带分别切下并酶切后,进行MALDI-TOF/TOF二级质谱分析,共鉴定出27种蛋白质,其中有些蛋白质是被报道过的定位于细胞间隙的蛋白质。 将小麦叶片全蛋白和细胞间隙液蛋白进行二维电泳(2-DE)分离,重复三次取平均值,分别检测到1247和522个蛋白点。而采用2D-DIGE技术分离全蛋白能够检测到1376个蛋白点,提高了定量的准确性并能够发现更多的蛋白点。 高效液相色谱技术可以弥补SDS-PAGE以及2-DE技术的缺陷。为了最大范围的分离分析细胞间隙液蛋白的成分,本文初步探索了HPLC技术分离小麦叶片蛋白的方法,比较了不同提取缓冲液和分离缓冲液的蛋白质HPLC分离效果。结果显示,1#(1M KH2PO4+K2HPO4)与3#(50mM Tris-HCl 10mM MgSO4,0.1%β-巯基乙醇,2mM PMSF)两种浸提缓冲液各有优势,等体积混合可以分离到最多的组分。而以0.1%TFA水溶液体系作为小麦叶片蛋白分离缓冲液可以获得最佳的分离效果。


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