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《西华师范大学》 2019年
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CRISPR/Cas9系统介导的小麦TaEPFL1基因编辑研究

吴一磊  
【摘要】:TaEPFL1基因是表皮模式建成因子(EPFL)基因家族的成员,EPFL基因家族参与调节植物一系列生长发育过程。为了更好的了解TaEPFL1基因在小麦生长发育过程中的作用,我们以中国春小麦成熟种子为材料,采用CRISPR/Cas9技术特异性编辑该基因外显子区域产生靶向敲除小麦。通过研究突变基因的作用,阐明该基因的正常功能。本研究分别探讨灭菌方式、麦草畏浓度、氨基酸组分和比例、农杆菌和成熟胚共培养时间、农杆菌和愈伤组织共培养时间等对愈伤组织诱导和生长发育的影响。具体研究结果如下:1、当75%酒精浸泡时间控制在180s,30%双氧水灭菌时间15s以上时,或当30%双氧水消毒时间控制在180s,75%酒精浸泡时间15s以上时,成熟胚均未染菌。麦草畏诱导中国春成熟胚愈伤组织的最适浓度是2.5 mg·L~(-1)。甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和亮氨酸是小麦成熟胚诱导的必须氨基酸。正交实验表明,中国春组培的最佳氨基酸配方为甘氨酸60.0 mg·L~(-1),天冬氨酸2.0 mg·L~(-1),脯氨酸2.0 mg·L~(-1),亮氨酸0.1 mg·L~(-1)。利用该培养体系,小麦成熟胚的出愈率达到97%。2、在遗传转化方面,小麦成熟胚与农杆菌共培养时间超过10h时,愈伤组织质量有所下降。同时还发现没有完全晾干的愈伤组织更容易感染和坏死。3、利用优化后的组培和遗传转化体系,我们成功获得一株转基因植株,该植株的一个氨基酸密码子由AAC转变为AGC,编码的氨基酸由天门冬酰胺(Asn,N)转变为丝氨酸(Ser,S)。通过qPCR检测,转基因植株的腺苷蛋氨酸合成酶(SAMsynthetase,sAMs)显著下调,ACC合成酶(ACCsynthetase,ACS)和ACC氧化酶(ACCoxidase,ACO)也受到微弱影响。该突变植株与相同环境下未突变的植株相比茎节更短,株高更矮小,并且结实较少。本研究优化了小麦成熟胚愈伤组织诱导的培养体系,为研究小麦氨基酸代谢的生理过程提供了参考;发现TaEPFL1基因对乙烯代谢途径有影响,为进一步研究TaEPFL1基因对小麦生长和发育的调控和该基因与乙烯代谢途径相互作用的分子机制提供科学依据。
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