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《西华师范大学》 2019年
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小麦雄性不育突变体HTS-1中TaEPFL1基因的克隆、定位及表达分析

孙清栩  
【摘要】:雄蕊是植物花器官的重要组成结构之一,它的生长发育情况会对植物的繁育和农作物的产量产生直接影响。雄性不育是雄蕊发育异常不能产生可育后代的一种自然现象,在杂交育种的过程中,雄性不育系植株在提高作物的产量、品质以及增强植物抗性和适应性等方面具有重要的作用。小麦(Triticum aestivum L.)是非常重要的粮食作物,在杂交制种中,小麦的雄性不育系可作为母本产生品质和产量优于亲本的杂交子代;该方法简便,可以消除人工授粉的困难还可提高后代种子纯度。因此,研究小麦雄蕊发育的过程对于利用分子育种技术改良小麦性状和提高小麦的产量具有重要的意义。小麦雄蕊同源转化型不育突变体HTS-1是彭正松教授首次在以三雌蕊突变体(Three pistils mutation,TP)为供体亲本和中国春(Chinese spring,CS)为受体亲本所构建的近等基因系(CSTP)群体中意外发现的一类新颖的小麦花器官突变体,属于CSTP的变异植株。在HTS-1的小花中雄蕊全部或部分的同源转化为雌蕊,故雄蕊数目少于3个,其雌蕊数目多于3个,雄蕊形态异常,无法产生正常可育花粉,故雄蕊全部或部分不育。而且,HTS-1与早期发现的核质互作的雄性不育小麦完全不同,该突变体无外源细胞质,该雌蕊化性状是由两个隐性核基因hts-1和hts-2共同调控,这一特性对于单独研究核基因控制的雄蕊同源转化为雌蕊的现象有很大的帮助。因此,HTS-1突变体是研究小麦花器官发育的优质材料。前期为了进一步研究雌蕊化性状产生的分子机制,杨在君等人对HTS-1的雌蕊化雄蕊(PS)和雌蕊(P)以及CSTP的雄蕊(S)进行RNA-seq分析,从中筛选得到一段表达序列标签(EST)序列(comp109492_c0),该序列所对应的基因在HTS-1和CSTP中出现差异性表达。在本研究中,我们将进一步研究该基因的结构与功能,探究其在小麦花发育过程中是否能够调控花器官的发育。通过基因克隆技术分别克隆出了目的基因的cDNA和基因组DNA序列,并对所得序列进行了氨基酸序列比对、染色体定位、创建系统发育树等生物信息学方面的分析,同时运用qRT-PCR分析了目的基因在花器官中的表达模式,随后通过拟南芥转基因技术进一步分析了该基因的功能,主要结果如下:1.克隆测序后经序列比对发现,该基因具有3个同源基因,而且三个同源基因的相似性高达98.18%,其氨基酸序列与节节麦(Aegilops tauschii)AeEPFL1分别具有100%,95.83%,95.83%的相似性,故将其命名为TaEPFL1.1,TaEPFL1.2,TaEPFL1.3(Gene Bank登录号分别为:MH638998.1,MH638999.1,MH639000.1)。3个同源基因的开放阅读框(ORF)长度为363bp,编码120个氨基酸,其中TaEPFL1.2和TaEPFL1.3的ORF完全相同。基因结构分析表明TaEPFL1的三个同源基因的序列长度分别为728bp、713bp和753bp,均由2个外显子和1个内含子构成,其对应外显子的长度无差异。2.通过以小麦双端体(Dt)和缺体-四体(NT)为材料的染色体定位分析表明TaEPFL1.1,TaEPFL1.2和TaEPFL1.3这3个同源基因分别位于染色体6D、6B和6A上。3.聚类分析表明TaEPFL1.1和TaEPFL1.2这两个同源序列与花药野生稻Oryza brachyantha ObEPFL1,二穗短柄草Brachypodium distachyon BdEPFL1,节节麦Aegilops tauschii AeEPFL1及拟南芥Arabidopsis thaliana AtEPFL1聚为一类,同属EPFL1蛋白,与节节麦(Aegilops tauschii)亲缘关系最近。4.Real-time PCR结果表明,TaEPFL1.1和TaEPFL1.2在花器官中表现出相似的表达模式,在雌蕊化雄蕊(PS)中表达量最高,约为正常雌蕊(P)的20倍,正常雄蕊(S)的15倍。5.通过TaEPFL1基因在拟南芥中过量表达,我们发现,野生型Col-0(Columbia)每朵小花的花丝数量始终为每朵花6条,而转基因植株每朵花的花丝数量为2到6条不等;在精确授粉阶段,Col-0的6条花丝的长度与柱头等长或更长,而转基因植株的花丝明显短于柱头,转基因的花丝与柱头比值在0.35-0.79之间;在生殖生长结束后,转基因植物的大部分角果都是短的、空的,不能产生种子,有些只有残余的花梗;在转基因拟南芥的叶片,花丝,角果中TaEPFL1的表达水平均显著高于野生型拟南芥;在转基因株系中,通过对控制乙烯合成通路的三个限速酶基因AtACS,AtSAM和AtACO2的表达水平进行分析,结果表明AtACO2表达量在转基因株系中显著降低,然而,AtACS和AtSAM的表达在这些转基因株系中没有显示出规律性的变化。本研究分析和鉴定了TaEPFL1基因的结构和功能。通过对TaEPFL1基因功能的研究,证实了TaEPFL1基因能够调控小麦雄蕊的发育,可能抑制乙烯的生物合成,为进一步阐明小麦雄蕊同源转化为雌蕊的分子机制提供了科学依据。
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