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《贵州大学》 2016年
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贵州黑山羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌分离鉴定

林聪宏  
【摘要】:目的:共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)对人体健康有诸多益处,大量研究表明天然CLA主要来源于反刍动物产品,而反刍动物瘤胃溶纤维丁酸弧菌是合成CLA的主要菌株。因此,通过开展贵州黑山羊瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的分离鉴定等试验研究,为后续进一步在菌株细胞水平深入研究和系统阐明CLA生物合成机制,以及开发利用贵州黑山羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌奠定基础。方法:以贵州黑山羊为试验动物,通过安装瘤胃瘘管,活体采集瘤胃液,采用现代分子生物学等实验手段开展贵州黑山羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌分离与鉴定等相关研究。结果:(1)给6只贵州黑山羊成功安装了改良瘤胃瘘管;(2)经过革兰氏染色、形态观察、16S r RNA序列分析和系统发育树构建后,1株菌鉴定为溶纤维丁酸弧菌,其16S rRNA GenBank登录号为X8997.1;革兰氏染色阴性,菌体呈弯曲杆状,有锥形端,菌落颜色为乳白色,菌落形状为圆形,半透明的粘稠菌落;在30℃~37℃和pH7.0环境下生长良好,硝酸盐不还原、产硫化氢阴性、触媒反应阴性但具有运动性等生理生化特征;(3)活体瘤胃灌注亚油酸(Linoleic Acid,LA)能促进贵州黑山羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌增殖,增加瘤胃共轭亚油酸(c9t11-CLA and t10c12-CLA)和反-11-油酸(t11-C18∶1,简称TVA)含量,提高亚油酸异构酶浓度。结论:瘤胃溶纤维丁酸弧菌常与其他厌氧菌处于伴生状态,极难分离纯化;连续3天灌注30mL食品级LA后,能促进贵州黑山羊瘤胃内CLA、TVA、亚油酸异构酶浓度和溶纤维丁酸弧菌数量不同程度的增加。
【关键词】:贵州黑山羊 溶纤维丁酸弧菌 分离鉴定 共轭亚油酸 16S rRNA序列
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S827;S852.6
【目录】:
  • 中文摘要6-7
  • Abstract7-8
  • 第一章 文献综述8-25
  • 1 贵州黑山羊概述8-10
  • 1.1 品种来源、分布及产区自然生态条件等8-9
  • 1.2 体型外貌和营养价值9-10
  • 2 瘤胃溶纤维丁酸弧菌概述10-15
  • 2.1 溶纤维丁酸弧菌介绍10-12
  • 2.2 溶纤维丁酸弧菌分离鉴定研究进展12-13
  • 2.3 溶纤维丁酸弧菌在共轭亚油酸的研究进展13-15
  • 3 共轭亚油酸概述15-23
  • 3.1 共轭亚油酸功能及来源15-17
  • 3.2 其他微生物合成共轭亚油酸研究进展17-20
  • 3.2.1 瘤胃细菌18
  • 3.2.2 丙酸菌18-19
  • 3.2.3 乳酸菌19-20
  • 3.3 共轭亚油酸分析检测方法20-23
  • 3.3.1 光谱分析21
  • 3.3.2 色谱分析21-23
  • 4 研究目的及意义23-25
  • 第二章 贵州黑山羊改良瘤胃瘘管的安装及护理25-31
  • 1 材料25
  • 1.1 试验动物25
  • 1.2 主要药物25
  • 1.3 主要仪器和器材25
  • 2 方法25-29
  • 2.1 术前准备25-26
  • 2.1.1 动物准备25
  • 2.1.2 麻醉前给药25
  • 2.1.3 全身麻醉25-26
  • 2.1.4 动物保定与术部无菌准备26
  • 2.2 术式26-27
  • 2.3 术后护理27-28
  • 2.4 瘘管安装28-29
  • 3 结果29
  • 4 讨论29-31
  • 第三章 LA对瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量的影响31-43
  • 1 材料31
  • 1.1 试验样品31
  • 1.2 主要试剂31
  • 1.3 主要仪器31
  • 2 方法31-38
  • 2.1 试验分组及样品采集31-32
  • 2.2 DNA提取32-33
  • 2.3 目的片段扩增33-35
  • 2.3.1 目的片段扩增33-34
  • 2.3.2 克隆34-35
  • 2.4 质粒DNA提取35-37
  • 2.4.1 菌液培养35
  • 2.4.2 质粒提取35-36
  • 2.4.3 质粒DNA浓度定量36-37
  • 2.5 荧光定量PCR37
  • 2.6 标准曲线的建立37-38
  • 2.7 拷贝数含量计算38
  • 2.8 统计分析38
  • 3 结果38-41
  • 3.1 荧光定量PCR扩增产物特异性38-40
  • 3.2 溶纤维丁酸弧菌数量的统计分析结果40-41
  • 4 讨论41-43
  • 第四章 瘤胃溶纤维丁酸弧菌分离鉴定43-54
  • 1 材料43-47
  • 1.1 试验样品43
  • 1.2 主要试剂及配制43-46
  • 1.2.1 主要试剂43
  • 1.2.2 试剂配制43-46
  • 1.3 主要仪器和器材46-47
  • 2 方法47-50
  • 2.1 瘤胃液采集及处理47
  • 2.2 瘤胃细菌的分离纯化47-49
  • 2.2.1 瘤胃细菌的分离48
  • 2.2.2 瘤胃细菌的纯化48-49
  • 2.3 菌种 16S rRNA序列分析49
  • 2.4 溶纤维丁酸弧菌的生理生化试验49-50
  • 2.4.1 革兰染色49
  • 2.4.2 硝酸盐还原试验49
  • 2.4.3 产硫化氢试验49
  • 2.4.4 触媒反应试验49-50
  • 2.4.5 运动性试验50
  • 2.4.6 不同温度(20℃、30℃、37℃、39℃、45℃)生长试验50
  • 2.4.7 好气性试验50
  • 3 结果50-52
  • 3.1 分离纯化结果50-51
  • 3.2 菌种 16S rRNA序列分析结果和系统发育树构建51-52
  • 3.3 生理生化结果52
  • 4 讨论52-54
  • 第五章 LA对CLA合成的相关研究54-67
  • 1 材料54-55
  • 1.1 试验样品54
  • 1.2 主要试剂和配制54-55
  • 1.3 主要仪器55
  • 2 方法55-60
  • 2.1 试验分组及样品采集55
  • 2.2 共轭亚油酸和反11油酸55-57
  • 2.2.1 样品前处理55-56
  • 2.2.2 CLA及反11油酸含量测定56-57
  • 2.2.3 统计分析57
  • 2.3 亚油酸异构酶测定57-60
  • 2.3.1 含酶菌体制备57
  • 2.3.2 粗酶制备57
  • 2.3.3 主要仪器参数设定57-58
  • 2.3.4 共轭亚油酸的标准曲线建立58-59
  • 2.3.5 亚油酸酶活力的测定59-60
  • 2.4 统计分析60
  • 3 结果60-65
  • 3.1 共轭亚油酸甲酯和反11油酸甲酯标样色谱图和百分比报告60-61
  • 3.2 共轭亚油酸和反11油酸统计分析结果61-64
  • 3.3 亚油酸异构酶浓度统计分析结果64-65
  • 4 讨论65-67
  • 第六章 结论与展望67-69
  • 1 结论67
  • 2 创新点67
  • 3 研究不足之处和展望67-69
  • 致谢69-70
  • 参考文献70-78
  • 附录78-81
  • 图版81-83

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