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《贵州大学》 2016年
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鸭源H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定与致病性分析

陈佳琪  
【摘要】:禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科A型流感病毒属成员,能感染所有鸟类和大部分哺乳动物。根据HA和NA蛋白抗原性差异,AIV可分为18个HA亚型(H1~H18)和11个NA亚型(N1~N11)。水禽被认为是AIV的巨大天然储存库,几乎所有亚型AIV均能从水禽中分离到。对水禽中AIV携带情况调查结果表明,H6亚型AIV是分离率最高的低致病性AIV。最近的研究发现,人感染的H5N6亚型AIV主要是由H5N1和H6N6病毒发生基因重排引起的。因此加强对H6亚型AIV的监测和遗传变异分析具有重要的公共卫生学意义。本实验于2014年11月从表观健康三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV,通过对其全基因组测序、遗传进化和致病性分析,旨在为家鸭中H6亚型AIV流行病学及遗传进化情况提供参考。1.H6N6亚型AIV分离鉴定及遗传进化分析:为了解贵州地区H6亚型AIV的流行情况和遗传进化特点,本研究采用鸡胚接种、血清学和RT-PCR方法从表观健康的三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV(命名为A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6),并对其进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析。结果表明,分离株HA裂解位点是“339PQIETRG345”,为非连续碱性氨基酸,其MDT和ICPI分别为98.4 h和0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的相似性最高(97.0%);而PB2基因与A/duck/Yamagata/061004/2014(H6N6)的同源性最高(96.9%),M基因与NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。以上研究结果表明,贵州省分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型病毒重组而成。2.鸭源H6N6亚型AIV对鸭致病性研究:为了解鸭源H6N6亚型AIV对麻鸭的致病性,将36只3周龄非免疫麻鸭随机分成两组:实验组以107.0EID50/0.1 mL的剂量通过滴鼻点眼方式接种病毒;对照组接种0.1 mL PBS。接种后分别于第1、3、5、7、9和11 d,采集咽喉和泄殖腔棉拭子,同时采集剖杀鸭的组织脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、法氏囊、胸腺),通过荧光定量RT-PCR来检测病毒排毒和组织脏器中病毒含量。另外,取部分脏器用于病理组织学检查。试验结果表明,鸭感染分离株后不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔未出现排毒现象。鸭感染后第3、5和7d在肺脏、脾脏、肝脏、脑、心脏均可以检测到病毒复制,除肺脏中第3 d病毒含量较高外,其它时间点的组织中病毒含量均不高。另外,病理组织学观察发现,在肺脏中可见少量炎性细胞浸润,其它组织无明显的病理变化。以上试验结果表明分离的H6N6亚型AIV对鸭的致病力弱,且在鸭体内的复制能力低。3.鸭源H6N6亚型AIV对免疫器官中细胞因子转录水平的影响:为了解鸭感H6N6亚型AIV后对免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平的影响,本试验通过荧光定量RT-PCR来检测鸭感染病毒后免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)中IL-2、IL-10和IFN-αmRNA表达动态变化。结果显示,本试验建立的相对荧光定量RT-PCR方法可以用于检测鸭IL-2、IL-10和IFN-αmRNA的转录水平。鸭感染H6N6后免疫器官中的IL-2、IL-10和IFN-α呈现不同程度的转录水平变化,不同的细胞因子在不同组织之间的转录水平差异较大。其中IL-2在法氏囊中的转录水平比在胸腺和脾脏中明显较高;IFN-α在胸腺和脾脏中的转录水平高于法氏囊;IL-10在免疫器官中转录水平较低。试验结果表明H6N6亚型AIV对鸭免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有一定的影响。综上所述:本试验分离到一株低致病性H6N6亚型AIV,该病毒可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型AIV重组而成;鸭感染分离株后无明显临床症状和病理组织学变化,喉头和泄殖腔不存在排毒现象;分离株对鸭免疫器官损伤轻微,并且对免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有影响。
【关键词】: 禽流感病毒 H6N6 基因组测序 致病性
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 中文摘要5-7
  • Abstract7-10
  • 英文缩略表10-11
  • 文献综述 H6亚型禽流感病毒研究进展11-21
  • 第一章 鸭源H6N6亚型AIV分离鉴定及遗传进化分析21-53
  • 1 材料21-22
  • 1.1 主要动物21
  • 1.2 主要试剂21-22
  • 1.3 主要仪器22
  • 2 方法22-28
  • 2.1 病毒分离22
  • 2.2 血清学鉴定22-23
  • 2.3 生物学特性测定23
  • 2.4 引物设计23-24
  • 2.5 全基因组RT-PCR的扩增24-26
  • 2.6 分离株全基因克隆及重组质粒的鉴定26-28
  • 2.7 分离株H6N6亚型AIV全基因组核苷酸序列测定及序列分析28
  • 3 结果28-50
  • 3.1 病毒的血清学鉴定结果28-29
  • 3.2 病毒的RT-PCR鉴定结果29-31
  • 3.3 病毒生物学特性的测定31-32
  • 3.4 病毒全基因组测序结果及同源性比对结果32-33
  • 3.5 编码氨基酸序列分析比较结果33-41
  • 3.6 核苷酸序列同源性比对结果41-46
  • 3.7 遗传进化分析46-50
  • 4 讨论50-53
  • 4.1 关于AIV分离鉴定方法50-51
  • 4.2 关于家禽在AIV传播中的作用51
  • 4.3 H6亚型AIV的遗传变异情况51-53
  • 第二章 鸭源H6N6亚型AIV对鸭的致病性研究53-65
  • 1 材料53-54
  • 1.1 主要毒株53
  • 1.2 主要动物53
  • 1.3 主要试剂53-54
  • 1.4 主要仪器54
  • 2 方法54-58
  • 2.1 鸭的致病性试验54-55
  • 2.2 H6亚型AIV M基因荧光定量检测方法的建立55-56
  • 2.3 鸭喉头、泄殖腔和组织器官中的病毒含量检测56-57
  • 2.4 H6亚型AIV感染鸭组织脏器的病理观察57-58
  • 3 结果58-62
  • 3.1 H6N6亚型AIV M基因重组质粒的构建与鉴定58-59
  • 3.2 H6亚型AIV M基因实时荧光定量RT-PCR检测方法建立59-61
  • 3.3 鸭感染H6N6亚型AIV后排毒及在组织器官病毒分布情况61
  • 3.4 鸭感染H6N6亚型AIV后病理组织学观察61-62
  • 4 讨论62-65
  • 4.1 关于H6N6亚型AIV的荧光定量RT-PCR检测方法的讨论62-63
  • 4.2 关于H6亚型AIV的致病性的研究63-65
  • 第三章 H6N6亚型AIV对鸭免疫器官中细胞因子转录水平的影响65-82
  • 1 材料65-66
  • 1.1 组织病料65-66
  • 1.2 主要试剂66
  • 1.3 主要仪器66
  • 2 方法66-68
  • 2.1 鸭IL-2、IL-10、IFN-α 质粒标准品的构建66-67
  • 2.2 鸭IL-2、IL-10、IFN-α 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立67-68
  • 2.3 H6N6亚型AIV感染鸭后免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α转录动态68
  • 3 结果68-79
  • 3.1 鸭IL-2、IL-10、IFN-α RT-PCR扩增结果68-73
  • 3.2 鸭IL-2、IL-10、IFN-α的测定结果73-74
  • 3.3 鸭IL-2、IL-10、IFN-α实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立74-77
  • 3.4 H6N6亚型AIV感染后鸭免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α转录动态77-79
  • 4 讨论79-82
  • 4.1 关于细胞因子mRNA转录水平的相对荧光定量RT-PCR检测79
  • 4.2 关于细胞因子在抗流感病毒感染中的作用79-80
  • 4.3 关于禽流感病毒感染后对宿主细胞因子转录水平的影响80-82
  • 全文结论82-83
  • 致谢83-84
  • 参考文献84-92
  • 附录一、发表文章92-93
  • 附录二、各种培养基、溶液及试剂的配制93-94
  • 附图94-95

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