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《贵州大学》 2016年
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耐FQs大肠杆菌敏感性恢复差异及机制研究

孙硕  
【摘要】:在不同条件下对耐药大肠杆菌进行传代培养,考察耐药菌对不同氟喹诺酮类药物(FQs)敏感性恢复中的差异,以及Plassmid-mediated quinolone resistance(PMQR)耐药基因和gyr A基因在传代前后是否发生变化。分析适合度代价对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响,以研究耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌敏感性恢复的条件及机制。寻找耐药细菌对药物的敏感性恢复的方法,为降低或消除细菌耐药性对人的健康和养殖业发展的危害提供帮助。1、将对环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和萘啶酸等6种喹诺酮类药物高度耐药的4株野生型大肠杆菌(E1、E2、E4、E7),在无药营养肉汤中进行传代培养,每天传代2次,连续传代80天,共计传代约480代,设3个重复;每5天测定一次6种药物对传代菌株的MIC值,观察传代对细菌耐药水平变化的影响。结果表明:经480代传代后环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星对E1、E2、E4、E7的MIC值均有一定程度的下降,但仍处于高度耐药水平,其中对环丙沙星的MIC平均降幅最大(为4.8倍);萘叮酸对4株菌的MIC值未发生变化。结论:对氟喹诺酮类药物高度耐药的野生型大肠杆菌在普通传代条件下其敏感性难以恢复,尤其是萘叮酸,建议在已经耐药的养殖场中不再使用该药。2、无药营养肉汤用生理盐水稀释8倍、16倍和32倍后,将4株野生型耐药大肠杆菌分别在其中传代培养,每天传代2次,连续传代60天,共计传代约398代;每5天检测环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星对传代菌株的MIC值,观察营养匮乏因素对细菌耐药水平变化的影响。结果表明:环丙沙星对四株耐药大肠杆菌的平均MIC由传代前的96μg/mL降低到了传代后的7μg/mL,MIC值的降幅最大,敏感性恢复最为显著;其次是诺氟沙星和氧氟沙星,分别由传代前的64μg/mL和40μg/m L降低到了传代后的11μg/mL和16μg/mL;而恩诺沙星和洛美沙星的敏感性虽有所恢复,但均未恢复至敏感或中介水平。结论:在不同的营养水平条件下进行传代培养,耐药菌对不同氟喹诺酮类药物的敏感性恢复存在差异,其中环丙沙星的敏感性最容易恢复,其次是诺氟沙星和氧氟沙星,耐药菌对恩诺沙星和洛美沙星的敏感性难以恢复至敏感或中介水平。3、对4株耐药大肠杆菌与一株敏感大肠杆菌的菌液分别按7/3、5/5和3/7的比例混合后在无药培养基中传代培养,共3个重复,每天传代2次,连续传代60天,共计约398代;每隔5天检测上述五种氟喹诺酮类药物对传代菌株的mic值,以观察生存竞争因素对细菌耐药水平变化的影响。结果表明:5种药物对混合培养菌群的mic值均降低,环丙沙星、诺氟沙星较于恩诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星更容易恢复至敏感或中介水平;并且混合培养菌液中敏感菌比例越高,其敏感性恢复越容易。结论:敏感细菌的竞争对耐药菌群的敏感性恢复有重要的影响。4、将对氟喹诺酮类药物表现为敏感的野生型大肠杆菌e685、e714、e746进行诱导耐药后,得到相对应的耐药菌株r685、r714、r746。将r685、r714、r746中混入少量敏感菌后连续传代培养,共3个重复,每天传代2次,总共传代240代,每隔5天测定五种氟喹诺酮类药物对传代菌株的mic值,得到敏感性恢复的菌株c685、c714、c746。并测定和绘制e714、r714、c714菌株在普通营养肉汤中的生长曲线。结果:r685、r714、r746等3株诱导耐药菌株中r714连续传代后(即c714),5种药物对其mic值降低速度最快、降幅最大,在传代150代后,恩诺沙星对c714的mic值降低到中介水平,其余四种药物对c714的mic则均降为敏感水平;而c685和c746对诺氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星的mic值降为敏感或中介水平,但对环丙沙星、恩诺沙星仍表现为耐药。结论:与野生型高度耐药大肠杆菌的敏感性恢复相比,短期诱导耐药的菌株其敏感性更容易得到恢复。并且耐药菌的生长速率较敏感菌低,细菌获得耐药性后可能会增加其生存适合度代价,而使其在无药环境的生存竞争中处于劣势。5、应用pcr方法对试验菌传代前后的pmqr耐药基因进行检测,考察耐药水平变化后耐药基因的携带情况。结果:在普通条件下进行传代培养,传代前后的试验菌内pmqr耐药基因的表型未见变化,这与它们耐药水平未发生变化相一致;在营养匮乏因子胁迫下传代,E2、E4、E7出现qnrB和aac(6‘)-Ib-cr耐药基因的丢失,与其敏感性得到恢复结果相一致;在不同的耐药/敏感菌比例下传代:E2、E7菌株qnr B耐药基因丢失,E2、E4、E7菌株aac(6‘)-Ib-cr耐药基因丢失,与其敏感性得到恢复结果相一致。诱导耐药菌株(R685、R714、R746)在耐药菌/敏感菌比例为95/5的条件下传代,C714出现qnrB、aac(6‘)-Ib-cr和qepA耐药基因的丢失,C685出现qnrB耐药基因的丢失,与其敏感性回复结果相一致。结论:qnr B、aac(6‘)-Ib-cr和qep A耐药基因在耐药大肠杆菌的传代过程中容易发生丢失,它们的丢失与对耐药菌的敏感性恢复起着重要的作用。6、通过基因测序分析试验菌株gyr A基因序列上耐药位点的突变情况。结果:耐药/敏感菌以三种不同比例混合后传代培养,原存在于E1、E2菌株gyr A基因序列上的83耐药突变位点消失;耐药/敏感菌以5/5和3/7比例混合传代培养,原存在于E4、E7菌株gyr A基因序列上的83和87耐药突变位点消失。结论:gyr A基因的83和87位点的突变是介导氟喹诺酮类药物高度耐药的主要原因。敏感性恢复菌株gyrA基因的83和87突变位点的消失,与传代中混入敏感菌的竞争抑制有关。
【关键词】:大肠杆菌 氟喹诺酮类药物 耐药性 传代培养 敏感性恢复 适合度代价
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.61
【目录】:
  • 中文摘要4-7
  • Abstract7-11
  • 缩略词11-12
  • 1 前言12-27
  • 1.1 大肠杆菌的流行性及耐药现状13-15
  • 1.1.1 大肠杆菌的流行性13-14
  • 1.1.2 大肠杆菌的耐药现状14-15
  • 1.2 氟喹诺酮类药物研究现状15-16
  • 1.2.1 氟喹诺酮类药物的发展史15
  • 1.2.2 大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制研究15-16
  • 1.3 氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展16-23
  • 1.3.1 靶基因突变17-18
  • 1.3.2 主动外排系统18-20
  • 1.3.3 膜通透性降低20
  • 1.3.4 质粒介导的氟喹诺酮类耐药20-23
  • 1.4 耐药细菌对抗菌药物敏感性恢复研究23-26
  • 1.4.1 耐药质粒消除23-24
  • 1.4.2 促进药物进入菌体24-25
  • 1.4.3 细菌的适合度代价25-26
  • 1.5 研究目的与意义26-27
  • 2 试验材料27-31
  • 2.1 菌株27-28
  • 2.2 质控菌株28
  • 2.3 试剂及仪器28-31
  • 2.3.1 培养基及配制28-29
  • 2.3.2 主要试剂及配置29
  • 2.3.3 试验药物及规格29-30
  • 2.3.4 主要仪器30-31
  • 3 试验方法31-43
  • 3.1 猪源大肠杆菌的分离与鉴定31
  • 3.2 大肠杆菌保种备用31-32
  • 3.3 喹诺酮类药物对猪源耐药大肠杆菌MIC的测定32-34
  • 3.3.1 抗菌药物储存液以及工作液的制备32-33
  • 3.3.2 细菌的活化和稀释33
  • 3.3.3 MIC值测定33
  • 3.3.4 结果判读33-34
  • 3.4 野生型耐药大肠杆菌的敏感性恢复研究34-35
  • 3.4.1 传代对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响34
  • 3.4.2 不同营养水平传代对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响34-35
  • 3.4.3 不同耐药/敏感菌混合比例传代对大肠杆菌敏感性恢复的影响35
  • 3.5 诱导耐药大肠杆菌敏感性恢复研究35-36
  • 3.5.1 敏感大肠杆菌的诱导耐药35
  • 3.5.2 耐药菌的敏感性恢复35-36
  • 3.5.3 敏感菌、诱导耐药菌和敏感性恢复细菌生长曲线的测定36
  • 3.6 氟喹诺酮类药物部分耐药基因的检测及分析36-40
  • 3.6.1 引物的选择36-37
  • 3.6.2 总DNA提取37-38
  • 3.6.3 PCR检测PMQR耐药基因38-40
  • 3.6.4 PCR产物测序及分析40
  • 3.6.5 GyrA和ParC耐药基因的测序分析40
  • 3.7 大肠杆菌GyrA和qnrB耐药基因的转移研究40-43
  • 3.7.1 大肠杆菌质粒DNA的提取40
  • 3.7.2 PCR检测质粒中GyrA和qnrB耐药基因40-41
  • 3.7.3 qnr B耐药基因的接合实验研究41-43
  • 4 结果与分析43-61
  • 4.1 普通传代前后大肠杆菌的MIC43-47
  • 4.2 不同营养水平传代前后耐药大肠杆菌MIC47-51
  • 4.3 不同的耐药/敏感菌混合比例下传代前后耐药大肠杆菌MIC51-54
  • 4.4 诱导耐药大肠杆菌敏感性恢复实验结果54-57
  • 4.5 细菌生长曲线测定57
  • 4.6 PMQR和gyrA耐药基因检测结果57-61
  • 4.6.1 普通传代前后PMQR耐药基因检测57
  • 4.6.2 不同条件下传代培养前后PMQR耐药基因的检测57-59
  • 4.6.3 敏感菌、耐药菌和恢复敏感性细菌耐药基因的检测59-60
  • 4.6.4 耐药基因gyrA和parC的突变情况60-61
  • 4.6.5 耐药基因qnrB接合阳性菌株药敏试验结果61
  • 5 讨论61-65
  • 5.1 普通条件下传代培养对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响62
  • 5.2 营养条件对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响62-63
  • 5.3 敏感菌的竞争抑制对耐药大肠杆菌敏感性恢复的影响63-64
  • 5.4 诱导耐药大肠杆菌敏感性恢复情况64-65
  • 5.5 gyrA和qnrB耐药基因的连接转化65
  • 6 结论65-67
  • 参考文献67-78
  • 附录Ⅰ78-79
  • 致谢79-80

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