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蓝莓花青素提取、纯化、成分鉴定及抗氧化活性的研究

冯贵涛  
【摘要】:蓝莓,又称越橘、蓝浆果,基本营养成分为果糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、紫檀芪、超氧化物歧化酶等,富含花青素,在小肠中的吸收率高,具有降血糖、抗炎、抗肿瘤和增殖作用。贵州省麻江县从2000年春开始引种蓝莓,到2008年止,共引入蓝莓4大类30个品种,其中,兔眼蓝莓12个,北高丛蓝莓10个,半高丛蓝莓4个,南方高丛蓝莓4个,并筛选出适宜的品种10个。但目前对贵州境内的蓝莓研究报道较少,本文以麻江产兔眼蓝莓(品种:园蓝)为研究对象,对其进行花青素的提取、纯化工艺的研究,同时对所含花青素种类进行鉴定,并对其体外抗氧化活性进行测定。本文成果主要体现在:1.采用超声辅助溶剂提取工艺,设计单因素试验考察不同酸化剂类型、酸化剂用量、超声温度、超声时间、乙醇体积分数、料液比、提取次数,根据单因素试验结果选取乙醇体积分数、盐酸用量及超声温度这三个因素设计响应面Box-Behnken试验,优化超声提取蓝莓花青素的提取工艺参数;后续纯化考查了乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附法纯化蓝莓花青素提取物的效果。最终优化后的提取条件为:超声温度40℃,盐酸用量为0.3%(V/V),乙醇体积分数为95%,超声时间20 min,1:6料液比提取3次,得提取物花青素187.92mg/100 g蓝莓。纯化条件:15 mL蓝莓粗提浓缩液,加入30 mL去离子水混合后,加入30 m L乙酸乙酯,萃取4次,花青素质量从粗提液187.92 mg/100 g减少至135.32 mg/100g。树脂纯化实验表明:AB-8树脂吸附率、解吸率更高,当吸附时间大于1.5 h后,花青素吸附已达到平衡;0.3%(V/V)盐酸酸化95%乙醇洗脱剂效果最好,最终70 mL洗脱剂就能将花青素洗脱完全,得到经AB-8大孔树脂纯化后花青素含量为95.83 mg/100 g。2.采用高效液相-质谱(HPLC-ESI-MS/MS)联用液相色谱(HPLC-PDA)鉴定并确认了贵州省麻江县种植的兔眼蓝莓(品种:园蓝)18个单体花青素,分别是:飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-半乳糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药-3-半乳糖苷、矮牵牛-3-阿拉伯糖苷、芍药-3-葡萄糖苷、锦葵-3-半乳糖苷、芍药-3-阿拉伯糖苷、锦葵-3-葡萄糖苷、矢车菊素、锦葵-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛素、芍药素、锦葵素。兔眼蓝莓中锦葵类占花青素总量36.93%,其次是矢车菊类占总量26.76%、飞燕类占总量16.69%,其中单体花青素含量最高为锦葵-3-葡萄糖苷15.86%。而市售蓝莓提取物(由上海惠城生物科技有限公司提供)花青素种类仅为四种,分别是:矢车菊-3-葡萄糖苷、芍药-3-葡萄糖苷、矢车菊素、芍药素。3.2,2-联苯基-1-苦基肼基,即DPPH?(λmax=515 nm)分光光度比色法测花青素(λmax=520 nm)抗氧活性时,反应剩余色素干扰明显,导致DPPH?的微弱的吸光度值变化难以读出。引进液相色谱法,根据花青素与DPPH?不同的保留时间,将其区别,避免了反应剩余花青素的干扰,利用DPPH?反应前后的峰面积差即可算出DPPH?自由基清除率,提高了数据的精准性。最终,单体花青素抗氧化实验中,自制蓝莓花青素中矢车菊素、矮牵牛素、芍药素、锦葵素完全反应,飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷,减少率分别为21.62、22.24、22.38%,其中矢车菊-3-葡萄糖苷面积减少率为4.04%。抗氧化活性最强的花青素单体分别为:矢车菊素、矮牵牛素、芍药素、锦葵素、飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷。实验室制备经乙酸乙酯萃取除杂后后的蓝莓提取物质量浓度为1 mg/m L时,清除率达到最高,为85.74%,而市售蓝莓提取物(由上海惠城生物科技有限公司提供)浓度为1.5 mg/mL时最高,清除率为80.64%。蓝莓粗提液的DPPH?自由基清除率为75.27%,经乙酸乙酯萃取除杂后4次后的蓝莓提取物DPPH?自由基清除率达到84.93%,经AB-8大孔树脂纯化后的蓝莓提取物DPPH?自由基清除率仅为74.16%。


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