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《贵州大学》 2017年
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菌根化马尾松Pht1家族磷转运蛋白基因的克隆及表达分析

张婷  
【摘要】:磷是植物生长发育所必需的营养元素之一。全球林业生产中,土壤中有效磷的缺乏是妨碍林业产能的主要限制性因子。自然界里大部分树种都能与外生菌根真菌建立了互利共生关系。这种共生关系一方面提高植物对矿质营养的吸收效率,另一方面作为回报外生真菌从植物身上获得有机碳来完成真菌的生命活动。马尾松(Pinus massoniana Lamb.),原产于我国南部地区的裸子植物针叶类,兼具经济和生态效益的重要森林树种之一。其主要分布在我国华中、华南和西南地区,长江以南大部分区域的森林土壤普遍缺磷,是制约其商品材发展的主要因素之一。马尾松是典型的外生菌根树种,外生菌根真菌向植株运输无机磷上有很大的贡献,然而这种现象背后的机制尚未完全清楚。其中磷转运蛋白基因在磷的吸收和利用上发挥至关重要作用,但菌根化马尾松磷转运蛋白在耐低磷胁迫中的功能及调控机制尚未知晓。本文以接种彩色豆马勃和美味牛肝菌的马尾松为材料,研究不同处理后种子的萌发、幼苗生长状况及生理生化特性等方面,探讨低磷环境中外生菌根菌对马尾松的促生作用;从低磷胁迫的菌根化马尾松中克隆Pht1家族磷转运蛋白基因,并分析其表达模式及相关生理特性;通过在烟草上的遗传转化验证其功能。主要结果如下:1)在盆栽条件下,菌根化马尾松幼苗的成活率、苗高、地茎、干重、根冠比均明显提高,但对种子萌发没有显著影响,根系活力、主根长、总根长、侧根数和根表面积等指标都显著优于对照;菌根化根系形成了菌套和哈氏网结构,且根系皮层横截面积比明显高于未接种根系,菌套面积比与株高、地茎呈正相关。ECM能降低MDA含量,提高CAT、SOD、POD、GSH-PX等抗氧化酶活性,减轻了自由基和活性氧对植物体的毒害作用。低磷胁迫下,接种ECM能促进幼年植株产生更多赤霉素,菌根化植株中可溶性糖和可溶性蛋白的含量显著性高于对照,表明外生菌根能改善马尾松幼苗的渗透势;ECM能显著提高植株针叶的叶绿素含量。2)利用RACE法首次克隆了4个马尾松磷转运蛋白基因(PmPTs登陆号分别为AMR43649.1、AMR43650.1、AMR43651.1和AMR43652.1)。PmPT1全长为2,388 bp,开放阅读框1,647bp、编码548个氨基酸残基;PmPT2全长为2,053 bp,开放阅读框1,647 bp、编码548个氨基酸残基;PmPT3全长为2,315 bp,开放阅读框1,608 bp、编码535个氨基酸残基;PmPT4全长为2,108 bp,开放阅读框1,608 bp、编码535个氨基酸残基。PmPTs属于H2PO4-/H+转运子,是MFS转运蛋白家族成员。生物信息学分析表明,PmPTs与其他植物类磷转运蛋白同源相似性很高,达到了74%-78%。马尾松PmPT1,2,3和4都具有Pht1家族蛋白基因高度保守的特征序列GGDYPLSATIMSE,系统进化树将其划分到裸子植物类亚组,与被子植物类磷转运蛋白亚组间亲缘关系比较接近,且高度进化和保守。PmPTs无信号肽输出,属于跨膜蛋白包含了12个跨膜结构域和1个亲水大环,推测定位于细胞膜上。3)利用RT-PCR和QRT-PCR技术分析了4个马尾松磷转运蛋白基因在不同磷浓度处理、不同组织中的表达水平。检测了接种ECM真菌马尾松根系中PmPTs的时空表达特征,与1st天相比,PmPTs的表达水平在6th天至24th天中都略有升高,且表达量都高于不接种对照。在24th后,被侵染ECM真菌的根系中PmPTs的表达量有显著性的提高。PmPT1,2,3和4基因在马尾松根、茎、针叶中都有表达,且受外生菌根菌的诱导,在不接种对照组中表达量:针叶根茎;而接种菌根菌植株里根系中的表达水平明显上升:根针叶茎。PmPTs属于菌根诱导型磷转运蛋白类,具有低磷条件被高效激活,高磷条件反而抑制其表达特征,且基因之间的表达模式比较相似。同时发现低磷环境中,菌根化马尾松植株的总磷含量高于不接种植株。我们推断根系中PmPTs基因的差异表达、植物磷的运输效率以及吸收量可能由磷转运蛋白基因的表达调控,其表达水平受外生菌根菌和土壤中无机磷浓度的集成信号综合调控。结合相关生理指标数据分析表明,在低磷环境中马尾松与ECM共生后,能通过提高磷转运蛋白基因的表达水平来增强植株耐低磷能力。4)构建植物表达载体pSH-35S-PmPT1,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导烟草(Nicotiana tabacum)的叶盘法遗传转化,经过抗性筛选和PCR检测后共得到31个转基因植株且收获了T0代种子。对T1代的2个高表达株系(Line-N1和Line-N2)进行不同浓度磷处理,采用RT-PCR和QRT-PCR分析发现,外源基因PmPT1会影响烟草自身Pht1家族磷转运蛋白基因的表达模式,增强了烟草内源NtPT1和NtPT2基因的表达水平,且低磷胁迫下显著性表达量,因此外源PmPT1基因和烟草Pht1家族2个成员NtPT1和NtPT2可能具有相互协作关系。在低磷胁迫下,Line-N1与Line-N2的地下部分和地上部分的总磷含量分别比野生型提高了33.3%、25.5%与30.7%、23.9%,其全株无机磷含量分别比野生型增加了42.9%和42.3%。且缺磷环境中转PmPT1基因株系的干物质量、叶绿体含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、保护酶活性(POD、SOD、CAT)均显著高于野生型,而MDA的含量显著降低。这表明超量表达马尾松PmPT1基因可以显著提高转基因烟草的耐低磷能力。综上所述,缺磷环境中外生菌根真菌能促进马尾松植株磷含量的积累,其部分原因应归结于磷转运蛋白基因表达水平的提高,同时也为创制耐低磷马尾松新种质奠定了基础。
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S791.248

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