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《贵州大学》 2017年
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马尾松抗旱相关基因的克隆及表达分析

蔡琼  
【摘要】:干旱是影响植物正常生长发育的重要逆境因子之一,直接影响林木正常代谢,导致植物细胞脱水,膜、酶系统遭到破坏,细胞功能丧失,进而导致林木代谢紊乱,影响林木产量和品质。马尾松是我国南方最主要的造林树种之一。截止目前,关于马尾松抗旱基因的基础性研究报道较少。因此,利用分子生物学手段,深入研究马尾松抗旱基因,探讨与揭示其抗旱机理和抗旱本质,进一步提高其抗旱能力,成为现代马尾松研究工作中急需解决的关键问题之一。本研究选用速生高抗旱马尾松优良家系83号(广西)1年生实生幼苗为供试材料,以期探究其在干旱胁迫中响应干旱的分子机理。主要研究内容与结果如下:(1)通过同源克隆技术从马尾松中获得APX、AQP、CBL、DHN、ERF、GPX、NAC、PEPC、POD 9个抗旱相关基因片段,初步证实了这些基因存在于马尾松中。然后利用RT-PCR及RACE技术克隆到7个马尾松干旱胁迫相关基因的cDNA全长,分别命名为PmNAC、PmERF、PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD。生物信息学分析表明,PmNAC含NAM结构域,与北美云杉亲缘关系最近;PmERF含AP2-ERF结构域,与油松亲缘关系最近;PmCBL3含EF-hand结构域,与北美云杉亲缘关系最近;PmDHN含Dehydrin结构域,与中欧山松亲缘关系最近;PmGPX6含GSH_Peroxidase结构域,与油松亲缘关系最近;PmPIP1含MIP保守区,与挪威云杉亲缘关系最近;PmPOD含Peroxidase结构域,与北美云杉亲缘关系最近。(2)通过对马尾松PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD基因在干旱胁迫下不同组织和不同处理时期进行表达分析,结果表明,PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD 5个基因在根、茎、叶中均受干旱诱导表达,并且在干旱胁迫下,呈先上升后下降的表达模式。推测基因可能参与马尾松干旱胁迫过程。同时克隆到马尾松PmACTIN内参基因片段。(3)根据基因酶切位点,共成功构建pBI121-PmPIP1、pSH737-PmCBL3、pBI121-PmGPX6、pBI121-PmPOD、pBI121-PmDHN 5个植物表达载体。为进一步通过基因遗传转化技术进行基因转化拟南芥奠定了基础。(4)采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得转PmGPX6(G1、G2、G4、G6、G7、G9)、PmPOD(P1、P2、P4、P5、P6)和PmDHN(D1、D3、D5、D7、D8、D10)的拟南芥株系。经抗旱性分析,结果表明:在含0%PEG 6000的条件下,转PmGPX6基因拟南芥与野生型拟南芥的表型与根长差异不大;在含3%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但野生型拟南芥根生长受到明显抑制,根的生长量明显降低。转PmGPX6基因拟南芥根系生长虽也受到干旱胁迫的抑制,但转PmGPX6基因拟南芥株系表现的干旱敏感程度明显低于野生型拟南芥,其根系远长于野生型拟南芥,两者间差异达到显著水平(P0.05)。转基因拟南芥不定根在蓝色光激发下,发出强烈的绿色荧光,表明PmGPX6基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。在含0%PEG 6000的条件下,转PmPOD基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株的表型与根长均无明显差异;在含4%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但转基因拟南芥的平均根较野生型拟南芥的平均根要长。转基因拟南芥不定根在蓝色光激发下,发出强烈的绿色荧光,表明PmPOD基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。干旱胁迫下,转PmPOD与野生型拟南芥叶片失水率均呈增长趋势,但转基因植株失水率低于野生型植株,呈显著差异(P0.05);转PmPOD拟南芥与野生型拟南芥脯氨酸含量均呈增长趋势,但转PmPOD拟南芥脯氨酸含量高于野生型植株;转PmPOD拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量均呈增长趋势,但转基因植株丙二醛含量低于野生型植株。野生与转基因拟南芥的脯氨酸、丙二醛含量均达显著差异水平(P0.05)。在含0%PEG 6000的条件下,转PmDHN基因拟南芥与野生型拟南芥的表型与根长均无明显差异;在含3.5%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但转基因拟南芥的平均根较野生型拟南芥的平均根要长。RT-PCR分析结果显示:PmDHN基因能够在转基因拟南芥中转录,在干旱胁迫下转基因株系转录水平较正常水分条件的表达水平均有提高。Southern blot显示野生型拟南芥没有杂交信号,转基因株系(D1、D3)均为2个拷贝。转基因拟南芥不定根发出强烈的绿色荧光,表明PmDHN基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。干旱胁迫下,转PmDHN与野生型拟南芥叶片失水率均呈增长趋势,但转基因植株失水率低于野生型植株,呈显著差异(P0.05);转PmDHN拟南芥与野生型拟南芥脯氨酸含量均呈增长趋势,但转PmDHN拟南芥脯氨酸含量较野生型植株分别增加7.79%、15.79%;转PmDHN拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量均呈增长趋势,但转基因植株丙二醛含量较野生型植株分别降低了4.08%、11.52%。野生型与转基因拟南芥的脯氨酸、丙二醛含量均达显著差异水平(P0.05)。(5)经表述分析与功能验证,PmAQP、PmCBL、PmDHN、PmERF、Pm GPX6、PmNAC、PmPEPC、PmPOD、PmACTIN基因已登录NCBI,PmGPX6、PmPOD、PmDHN基因具有抗旱功能。
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S791.248

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