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《贵州大学》 2019年
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枯草芽孢杆菌酱(豉)香风味基因的筛选及功能研究

钟杰  
【摘要】:枯草芽孢杆菌高温发酵的酱香型食品(如白酒)、中低温发酵的豉香型食品(如豆豉)都受到人们的青睐,但酱香和豉香的产生机制至今还不清楚。研究通过对豆豉工业生产菌株Bacilus subtilis BJ3-2进行中温(45℃)和中低温(37℃)的转录组测序差异性和富集分析,筛选得到19个差异显著基因,分析选取5个显著差异基因作为风味候选基因并进行荧光验证,最终选取rocF(精氨酸酶)进行同源重组,双交换敲除以验证其在酱(豉)香上的生理功能,主要研究内容及结果如下:1.对Bacilus subtilis BJ3-2中温(45℃)、中低温(37℃)进行第二代转录组测序。通过表达量分析、差异基因的GO、KEGG注释和富集分析,将差异显著的58个基因富集在27个代谢通路,其中嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢最为显著。控制筛选条件Fold-change≧2与FDR≦0.05,最终筛选出19个显著差异基因,结合文献报道和综合分析,选择rocF(精氨酸酶)、rocG(谷氨酸脱氢酶)、uxaC(葡萄糖醛酸异构酶)、uxuA(甘露酸脱氢酶)、pckA(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)为酱(豉)香候选基因。2.对转录组筛选出来的5个酱(豉)香候选基因进行荧光定量PCR验证。选用16S rRNA为内参基因,分别确定了5个酱(豉)香候选的基因的溶解曲线和扩增曲线,并计算出各自的基因表达差异,结合转录组差异发现,除uxaC外,rocF、rocG、uxuA、pckA的表达趋势和转录组测序的结果一致。3.构建rocF的同源重组双交换敲除载体:pUC18+HLarm+CmR+HRarm。以pUC18为初始载体,依次通过Sac I、BamH I、Pst I、Hind III限制性酶切位点将从BJ3-2基因组扩增的左臂(HLarm)、右臂(HRarm)以及pHT01cas9-p43载体上的氯霉素基因(CmR)连接,并通过菌落PCR、质粒PCR、双酶切、测序验证,最终获得pUC18+HLarm+CmR+HRarm重组交换载体。4.将双交换质粒载体转化BJ3-2中,转化效率达5×10~2cfu/μg,并通过革兰氏染色、RCR验证、测序验证,最终成功筛选出BJ3-2△rocF基因敲除菌株。5.利用BJ3-2△rocF和BJ3-2发酵豆豉,感官评定和氨气检测显示:BJ3-2△rocF发酵的豆豉较BJ3-2发酵的豆豉,37℃时,颜色、豉香、酱香、质地、氨味均无明显变化,仅黏丝略有降低;45℃时,颜色褐化程度降低,黏性增强,酱香味更加突出,氨味降低112.9 ppm。由实验结果得出:BJ3-2△rocF和BJ3-2 37℃发酵的豆豉感官变化不大,说明37℃时rocF与酱豉香风味无显著关系;传统认为褐化与酱香呈正相关,但45℃时,BJ3-2△rocF发酵的豆豉褐化程度减弱,说明褐化与酱香风味没有相关性,酱香味增强说明rocF是酱香风味重要的负调控基因,氨味降低,说明rocF通过精氨酸代谢影响氨气含量。研究通过成功敲除rocF,为研究酱(豉)香风味基因的功能提供了方法借鉴;通过转录组测序、荧光定量PCR验证、基因敲除等手段为探索酱香和豉香型产品中风味的形成机制提供了一定的理论基础。
【学位授予单位】:贵州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TS201.3

【参考文献】
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