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FAD8基因遗传转化小油桐提高幼苗抗寒性研究

胡远  
【摘要】: 小油桐(Jatropha curcas L.)属大戟科(Euphobiaceae)落叶灌木或小乔木。其种仁含油量高,干果产量大,油脂组成符合生物柴油油脂标准,是生物柴油的理想原料。但其生长易受低温和干旱伤害。因此,研究以生物技术改良其脂肪酸组成、提高抗寒性具有重要意义。拟南芥脂肪酸脱饱和酶FAD8基因编码ω-3脂肪酸脱饱和酶(ω-3fad),催化以二烯酸底物脱饱和形成三烯酸,可增加小油桐植株不饱和脂肪酸含量,在低温下其表达量提高,可提高膜脂的流动性,增加植物的抗寒能力。本研究建立了小油桐高效遗传转化体系,利用本实验室克隆的拟南芥FAD8基因构建表达载体遗传转化小油桐,鉴定并筛选转基因小油桐植株,研究了FAD8基因脂肪酸代谢和抗寒性的影响。获得结果如下: 1、小油桐高效再生体系的建立 去壳消毒小油桐种子,沿纵轴切开胚乳,挑出幼胚接种于MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L的萌发培养基中培养无菌苗。以15天苗龄的无菌苗为外植体,子叶最佳分化培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L,分化率为82.9%;下胚轴最佳分化培养基为MS+6-BA2mg/L+IBA 0.2mg/L,分化率为23.8%;子叶柄最佳再生培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA0.1mg/L,分化率为32.7%。在小油桐再生培养基中添加1.0mg/L的AgNO_3能促进小油桐植株再生,并抑制褐化。将小油桐再生芽苗接种于WPM培养基中生根,生根率为29.6%。本研究中,小油桐各外植体再生率均高于以往报道,首次以子叶柄获得再生苗。 2、农杆菌介导小油桐遗传转化体系建立 采用农杆菌介导法将FAD8基因(载体为pSH-FAD8)遗传转化小油桐:以15天苗龄的小油桐无菌苗的下胚轴、子叶、子叶柄为外植体,置于含200μg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液中进行侵染,子叶、子叶柄侵染8min,下胚轴侵染10min,28℃暗室中共培养3天后置含头孢霉素100mg/L的MS+6-BA3mg/L+IBA0.5mg/L培养基中脱菌生长5天,再接种至筛选培养基中培养,筛选条件是子叶和子叶柄利用卡那霉素30mg/L筛选;下胚轴以卡那霉素50mg/L筛选。将以GUS染色检测出的阳性植株进行PCR、RT-PCR检测,确定转基因小油桐植株27棵。与以往报道相比,本研究中建立的遗传转化体系更加完善,并获得了转基因植株。 3、提取0.5g转基因及对照小油桐叶片脂肪酸进行反相薄层层析,结果初步显示转基因小油桐叶片脂肪酸组成成分没有发生改变。 4、抗寒生理指标检测结果表明,与对照相比转基因植株表现出抗寒性增强的生理生化特性。筛选出两个抗寒能力最强的转基因小油桐单株,经低温处理后发现,与对照相比较,其叶绿素破坏较轻,过氧化氢酶、过氧化物酶活性增加更多,丙二醛含量、脯氨酸含量也有较多增加。


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