Hedgehog信号通路在慢性氟中毒大鼠软骨损害中的作用及其机制

【摘要】：目的:通过体内外染氟实验及体外Smo siRNA阻断Hh信号通路,观察氟致大鼠软骨损害中Hh信号通路相关因子表达水平变化及软骨细胞凋亡情况,以探讨氟中毒致软骨损伤的发病机制,为地氟病的预防及治疗提供实验依据。方法:(1)体内实验:36只健康SD大鼠按体重随机分为对照组(饮用含氟量1 mg/L自来水)、低氟组、高氟组(饮水含氟量分别为5 mg/L、50 mg/L),每组12只(雌雄各半)。饲养6个月后,股动脉放血处死,应用氟离子电极法检测各组大鼠尿氟、骨氟含量;HE染色后光镜观察关节软骨组织病理形态学的改变;IHC和Wb法检测软骨组织Hh信号通路中Shh、Smo、BMP-2及凋亡相关调控蛋白Bcl-2及Bax表达情况。(2)体外实验:取1周龄健康SD大鼠4只,用机械-酶消化法分离关节软骨细胞;甲苯胺蓝对原代软骨细胞进行鉴定,常规细胞培养,待细胞传至2代细胞融合至70%时,分别加入浓度为0(对照组)、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mM的含氟培养基进行培养,培养72 h后采用MTT法检测各组细胞的增殖情况,筛选出最适氟浓度;以慢病毒为载体将Smo siRNA1~3转入软骨细胞,72 h后,Wb检测Smo表达含量,筛选出抑制作用最强片段后将实验分为空白对照组、氟中毒组、control siRNA(阴性对照)组及Smo siRNA组;各组细胞培养72h后采用Wb检测Shh、Smo、BMP-2、Bcl-2和Bax蛋白表达情况;逆转录PCR检测Shh、Smo、BMP-2 mRNA表达水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:1、低氟组及高氟组的尿氟、骨氟(3.66±0.43、402.38±33.77;8.05±0.60、935.12±49.60)含量均较对照组(1.12±0.16、106.45±11.28)升高,差异有统计学意义(P0.05);2、HE结果显示,对照组大鼠软骨边缘基本整齐,细胞呈柱状排列。随着染氟剂量增加,各染氟组干骺端出现不同程度软骨骨化,骨小梁增宽,具有硬化性氟骨症改变。3、Wb结果显示,低氟组、高氟组Shh、Smo、BMP-2及Bax蛋白表达(0.86±0.09、0.92±0.11、1.02±0.10、0.91±0.14;1.11±0.15、1.17±0.15、1.13±0.12、0.92±0.11)较对照组(0.62±0.07、0.74±0.09、0.77±0.11、0.63±0.06)升明显升高,Bcl-2蛋白表达(0.78±0.03;0.57±0.09)较对照组(0.84±0.10)明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。4、原代软骨细胞提取成功,表现为经甲苯胺蓝染色时,细胞内可见紫红色的异染颗粒。5、MTT结果显示,染氟72 h后,浓度为0.125、0.25、0.5 mM组细胞活力(120.83±7.21、123.17±4.62、118.51±10.09)较对照组升高,浓度为1.0、2.0、4.0 mM组细胞活力(82.13±6.25、35.16±4.84、7.03±2.23)较对照组降低,差异有统计学意义(P0.05)。6、Smo siRNA1~3均可不同程度抑制Smo因子的表达,以Smo siRNA2片段抑制作用最强。7、Wb及逆转录PCR结果显示,氟中毒组与阴性对照组Shh、Smo及BMP-2蛋白(0.94±0.05、0.89±0.07、1.06±0.15;1.00±0.09、0.86±0.05、1.14±0.13)和mRNA(0.67±0.04、0.46±0.06、0.77±0.06;0.61±0.04、0.51±0.07、0.79±0.06)的表达较空白对照组(0.70±0.06、0.69±0.06、0.83±0.12;0.53±0.06、0.34±0.03、0.69±0.06)明显升高,Smo siRNA组(0.52±0.03、0.47±0.06、0.59±0.06;0.42±0.05、0.28±0.06、0.50±0.03)与空白对照组及阴性对照组相比其表达均降低,差异有统计学意义(P0.05)。8、流式结果显示,与空白对照组细胞凋亡率相比(11.04±1.11),氟中毒组与阴性对照组细胞凋亡率(18.49±0.80;17.97±1.07)明显升高,Smo siRNA组(40.32±1.79)升高更为明显。与空白对照组Bax、Bcl-2的表达及Bax/Bcl-2的比值(0.88±0.06;1.05±0.07;0.85±0.09)相比,氟中毒组与阴性对照组Bax表达(1.07±0.10;1.19±0.12)升高,Bcl-2表达(0.74±0.03;0.76±0.05)降低,Bax/Bcl-2比值(1.45±0.13;1.56±0.15)升高,Smo siRNA组(1.39±0.10;0.50±0.03;2.29±0.21)变化更为明显,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1、氟中毒时软骨组织可出现不同程度的骨化,具有硬化性氟骨症的病理改变。2、在一定条件下,低浓度的氟对大鼠原代软骨细胞具有促进增殖作用,而高浓度具有促进凋亡作用。3、Hh信号通路可能与凋亡以及其它因素共同参与氟致软骨损伤的机制及发病过程。

【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R599.1