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《遵义医学院》 2018年
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中药栀子对APP/PS1/Tau三转基因阿尔茨海默症小鼠药理活性研究

董璐萌  
【摘要】:目的:阿尔茨海默病(Alzheimer?s disease,AD)是一种起病隐匿,慢性的进行性神经系统退行性疾病。临床上主要表现为记忆认知功能障碍、失认及人格和行为改变。AD典型病理特征是β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)在脑内沉积形成老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白异常磷酸化形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。中药栀子(Gardenia jasminoides Ellis)提取物中含有多种化学成分,其中主要为栀子苷和西红花苷,栀子具有促进神经元再生、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等多方面药理活性。栀子抗AD药理活性的发挥,栀子苷和西红花苷-1在其中发挥的药理作用,目前未见文献报道。因此,本课题通过对中药栀子提取,并分离纯化栀子苷和西红花苷-1部位,采用三转基因AD模型(3×Tg-AD)小鼠在体外和体内药理模型水平上对栀子成分抗AD药理活性进行系统研究。方法:1.栀子GE、TIG与TC制备及分析栀子药材粉碎,60%乙醇提取,浓缩,冷冻干燥得栀子提取物(gardenia extract,GE)。经HPD-100大孔吸附树脂吸附,25%乙醇和65%乙醇分别洗脱,分别获得总环烯醚萜苷(iridoid glycosides,TIG)和总西红花苷(total crocins,TC)。采用UPLC与LC-MS色谱技术对GE、TIG与TC 3个部位中栀子苷和西红花苷-1进行分析鉴定和含量测定。2.栀子苷和西红花苷-1对3×Tg-AD小鼠海马原代神经元保护作用采用海马原代神经元细胞药理模型对比研究栀子苷和西红花苷-1抗AD药理活性。新生鼠,取海马,铺板、种植、消化和培养7天,第8天分别加入10μM栀子苷和西红花苷-1,提取细胞蛋白用于Western Blot检测Aβ1-42、Tau S396、GSK-3β和Bcl-2蛋白表达水平。3.GE、TIG与TC对3×Tg-AD小鼠药理活性研究28只4月龄雄性3×Tg-AD小鼠随机分为4组,每组7只,分别为对照模型组(3×Tg-AD)、栀子提取物组(GE)、总环烯醚萜苷组(TIG)、总西红花苷组(TC)。GE、TIG及TC以100 mg/Kg/Day剂量分别灌胃3×Tg-AD小鼠。持续给药8周。第9周,给药结束采用Morris水迷宫实验对小鼠进行行为学测试,包括定位航行实验和空间探索实验,评价GE、TIG与TC对3×Tg-AD小鼠学习能力与记忆功能改善作用。HE染色观察小鼠海马区神经元细胞形态学的变化,IHC观察脑组织中海马区蛋白APP、Aβ1-42和Tau S396相对表达水平,Western Blot法检测海马中蛋白APP、Aβ1-42、BACE1、Tau S396、GSK-3β、Bcl-2和BAX相对表达水平,ELISA试剂盒检测血清中致炎因子TNF-α和Il-1β的浓度改变。综上,分别从行为学实验、病理形态学、分子生物学和免疫学多方面系统评价栀子主要抗AD药理活性成分。结果:1.UPLC和LC-MS测定结果显示,GE主要成分为栀子苷和西红花苷-1,外标法计算含量结果分别为33.4%和15.1%。TIG主要成分为栀子苷,外标法计算含量结果为62.2%。TC主要成分为西红花苷-1,外标法计算含量为42.4%。2.栀子苷给药后3×Tg-AD小鼠海马神经元中Aβ1-42蛋白表达水平明显下调(P0.01),Tau S396蛋白表达水平显著降低(P0.05)。与Aβ沉积和Tau蛋白磷酸化有密切关系的GSK-3β蛋白表达水平也显著降低(P0.01),与神经细胞凋亡相关抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上调(P0.05)。同时,西红花苷-1对蛋白Aβ1-42表达明显下调(P0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2显著升高(P0.05),而对磷酸化途径Tau S396、GSK-3β表达虽有药理活性,但均不具有统计学差异(P0.05)。3.行为学测试Morris水迷宫实验结果显示,与3×Tg-AD模型组比较,TIG组与TC组逃避潜伏期均显著减少(P0.05),原平台所在象限停留时间明显增加(P0.05),穿越原平台次数增加但不明显。GE组水迷宫实验中均不具有统计学差异(P0.05)。HE染色结果显示,与3×Tg-AD模型组比较,GE组、TIG组、TC组细胞排列紧密,着色均匀,浓染细胞减少。IHC数据结果显示,与3×Tg-AD模型组比较,GE组、TIG组和TC组中APP蛋白棕色斑块减少,阳性表达均明显下降(P0.001)。Aβ1-42蛋白和Tau S396蛋白在TIG组和TC组阳性表达均明显下降(P0.05)。Western Blot分析结果显示,3×Tg-AD模型小鼠经GE、TIG与TC给药后,小鼠海马内的APP蛋白表达明显降低(P0.01)。与3×Tg-AD模型小鼠相比,TIG组与TC组的海马内Aβ1-42蛋白表达量均显著降低(P0.05),与Tau蛋白磷酸化相关蛋白GSK-3β以及Tau S396表达量显著降低(P0.05),去磷酸化蛋白PP2A表达水平明显上调(P0.05),抗凋亡因子Bcl-2表达水平均显著升高(P0.05),且促凋亡因子BAX表达水平均明显降低(P0.05)。与3×Tg-AD模型组比较,3个部位给药组BACE1蛋白表达降低,但只有TC组具有统计学差异(P0.05)。ELISA结果显示:致炎因子TNF-α及IL-1β在GE、TIG和TC组均明显下降(P0.05)。结论:1.栀子经HPD-100大孔吸附树脂吸附、洗脱后获得富集栀子苷和西红花苷-1的TIG与TC部位。2.栀子苷与西红花苷-1能降低3×Tg-AD小鼠原代海马神经元内Aβ表达,抑制神经元凋亡,对体外AD模型具有药理活性。3.栀子提取的TIG与TC部位可提高3×Tg-AD小鼠认知能力,改善3×Tg-AD小鼠记忆功能。抑制AD小鼠脑内神经元凋亡和血清中炎症反应,减少海马中Aβ表达,抑制Tau蛋白异常磷酸化,具有抗AD药效。栀子提取部位栀子苷与西红花苷-1含量对栀子抗AD药效发挥有重要意义。4.今后对栀子抗AD药物分析研究中可将TIG与TC作为主要质量控制指标,栀子在未来抗AD治疗药物研发方面前景广阔。
【学位授予单位】:遵义医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285.5

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【参考文献】
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