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《遵义医科大学》 2020年
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海马miR-181c在CCI大鼠神经痛中的作用及其表达调控机制的初步研究

杨帆  
【摘要】:疼痛是与实际或潜在的组织损伤相关的一种不愉快的感觉和情感体验。近年研究表明,海马参与了外周神经损伤后的痛觉感受。微小RNA(microRNA)是真核生物中的一种非编码RNA,可以通过靶向特定mRNA进行降解或抑制翻译来调节基因表达。近年研究表明,miR-181c表达于海马组织,给予外源性miR-181c可以减轻海马神经元凋亡,其机制可能是由于抑制TLR4(Toll like receptor 4,Toll样受体4)信号通路活化导致IL-1β(Interleukin-1 beta,白介素1β)和TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha,肿瘤坏死因子-α)表达下降。此外,mRNA芯片技术结合双荧光素酶报告基因载体技术证明,TNF-α和TLR4是miR-181c的直接下游靶点。近年研究表明,海马TNF-α和TLR4表达上调参与了疼痛感受以及痛情绪的产生等。由此,初步推测:海马补充miR-181c有可能通过下调TLR4及TNF-α表达来缓解CCI(Chronic constriction injury of sciatic nerve,坐骨神经慢性压缩性损伤)大鼠神经痛。本研究将从疼痛的神经化学层面探讨海马miR-181c在CCI大鼠神经痛中的作用及其表达调控机制。目的:1.阐明海马miR-181c是否通过下调TNF-α和TLR4表达,缓解CCI大鼠神经痛。2.阐明海马CA1区注射NF-κB活性抑制剂PDTC能否通过抑制NF-κB活化,上调转录因子CTCF表达,从而促进miR-181c生成,缓解CCI大鼠神经痛。方法:1.选用30只5~6周龄SD雄性大鼠,均行左侧CCI术,随机分成3组:假手术组(Sham组)、CCI3天组、CCI7天组。于术前1天,术后第1、3、5、7天测定TWL(Thermal withdrawal latency,热缩足潜伏期);分别于第3、7天取海马,RT-qPCR检测miR-181c、TLR4和TNF-αmRNA表达,Western Blot(WB)检测TLR4和TNF-α蛋白的表达。2.选用54只5~6周龄SD雄性大鼠,双侧海马CA1区植入套管,随机分6组:Sham组、CCI+vehicle(生理盐水)组、CCI+激动剂阴性对照组(CCI+miR-181c agomir NC)、CCI+抑制剂阴性对照组(CCI+miR-181c antagomir NC)、CCI+激动剂组(CCI+miR-181c agomir)、CCI+抑制剂组(CCI+miR-181c antagomir)。在CCI术后第1-7天,sham组及CCI+vehicle组海马注射生理盐水0.5μL(2次/日)。CCI+agomir/antagomir阴性对照组注射各自的阴性对照(20 nM,0.5μL,2次/日)。CCI+miR-181c激动剂/抑制剂组注射miR-181c agomir或miR-181c antagomir(20 nM,0.5μL,2次/日)。在术前1天,术后第1、3、5、7天测定给药1 h后的TWL;在第7天取海马,RT-qPCR检测miR-181c、TNF-α和TLR4 mRNA的表达;WB检测CTCF、Nrf2、TLR4及TNF-α蛋白表达。3.选用40只5~6周龄SD雄性大鼠,双侧海马CA1区植入套管,随机分4组:Sham组、Sham+PDTC、CCI+vehicle(生理盐水)、CCI+PDTC组。CCI+PDTC组大鼠双侧海马持续7天注射PDTC(0.5μg/μL,2次/日)。Sham和CCI+vehicle组注射等体积的生理盐水。于术前1天,术后第1、3、5、7天测定给药1 h后的TWL;在第7天取海马,RT-qPCR检测miR-181c表达;WB检测CTCF、NF-κB p65及NF-κB p50蛋白表达。结果:1.热痛阈结果显示,与sham组相比,CCI组术后TWL明显下降。RT-qPCR和WB结果显示,与sham组相比,CCI组海马TLR4和TNF-α的mRNA及蛋白表达在损伤后第3天开始上升,在第7天上升更明显。与sham组相比,CCI组海马miR-181c表达于术后第3天下降,第7天下降更为显著。2.与CCI组相比,海马注射miR-181c agomir后,神经损伤大鼠的TWL明显升高。与CCI组相比,海马注射miR-181c antagomir的神经损伤大鼠TWL下降。RT-qPCR和WB结果显示,与Sham组比较,CCI组海马TLR4和TNF-αmRNA及蛋白表达显著升高,miR-181c表达显著下降。与CCI组相比,miR-181c agomir处理组海马TLR4和TNF-αmRNA及蛋白表达显著下降,miR-181c表达显著上升。与CCI组相比,注射miR-181c antagomir之后,神经损伤大鼠TLR4和TNF-α蛋白及mRNA表达上升更为明显,miR-181c表达下降更为明显。与Sham组相比,CCI组海马组织胞浆和胞核CTCF表达明显下降,胞浆Nrf2表达明显下降而胞核Nrf2表达明显升高。与CCI组相比,CA1区注射miR-181c agomir后神经损伤大鼠海马组织胞浆、胞核CTCF表达明显升高,但胞核Nrf2表达明显降低,胞浆Nrf2有所上升。与CCI组相比,CA1区注射miR-181c antagomir后,神经损伤大鼠海马CTCF和Nrf2在胞浆、胞核的表达均无明显变化。注射miR-181c agomir或antagomir阴性对照不影响CCI大鼠TWL变化,不影响海马TLR4、TNF-α、CTCF和Nrf2表达。3.与CCI组相比,海马注射PDTC后,神经损伤大鼠TWL明显升高。RT-qPCR结果显示,与Sham组比较,CCI组海马miR-181c表达显著下降。与CCI组相比,PDTC注射治疗组海马miR-181c表达显著上升。与Sham组相比,CCI组海马胞浆CTCF、NF-κB p50和p65表达明显下调,胞核NF-κB p50和p65表达明显上调,胞核CTCF表达明显下调。与CCI组相比,CA1区注射PDTC后,神经损伤大鼠海马CTCF、NF-κB p50和p65在胞浆的表达明显上调,胞核NF-κB p50和p65表达明显下调,但胞核CTCF表达明显上调。结论:1.海马注射miR-181c激动剂可以明显减轻CCI大鼠热痛觉过敏,抑制CCI引起的TLR4和TNF-α表达增加。2.海马注射PDTC通过抑制NF-κB活化,上调转录因子CTCF表达,从而促进miR-181c生成,缓解CCI大鼠神经痛。
【学位授予单位】:遵义医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:R338.3

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