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《遵义医科大学》 2020年
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ATF5在鼻咽癌侵袭和转移中的作用及其机制研究

范尔兮  
【摘要】:目的:探讨转录激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)对鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力的影响及其可能分子机制。方法:以人鼻咽癌CNE2Z细胞为研究对象,采用慢病毒载体shRNA-ATF5干扰技术沉默CNE2Z细胞ATF5表达及实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测慢病毒shRNA-ATF5载体干扰效率;以未感染慢病毒的CNE2Z细胞作空白对照(Control组),慢病毒空载体LV-shRNA-NC感染CNE2Z细胞作为阴性对照(NC组),慢病毒载体shRNA-ATF5(LV-shRNA-ATF5)感染CNE2Z细胞为实验组(shRNA-ATF5组);再运用噻唑蓝(Methylthiazolyl Blue Tetrazolium,MTT)法及克隆形成实验检测CNE2Z细胞增殖能力,划痕实验、Transwell迁移实验、侵袭实验检测CNE2Z细胞迁移及侵袭能力;采用Affymetrix人类基因表达谱芯片技术比较感染shRNA-ATF5慢病毒后CNE2Z细胞中基因表达的变化及独创性通路分析(Ingenuity pathway analysis,IPA)富集到与ATF5相关的整合素连接激酶(Integrin linked kinase,ILK)信号通路,并通过蛋白免疫印记法(Western blotting)分析CNE2Z细胞沉默ATF5后E-钙黏蛋白(E-cadherin)N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)、波形蛋白(Viminetine)等上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白及ILK、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达水平变化,再观察ATF5过表达慢病毒载体对CNE2Z细胞ILK及GSK3β表达水平的影响。结果:(1)qRT-PCR和Western blot检测结果均显示,shRNA-ATF5慢病毒载体能显著抑制鼻咽癌CNE2Z细胞ATF5的表达(P0.05),干扰效率可达91.2%。(2)MTT检测结果显示,shRNA-ATF5组CNE2Z细胞较NC组增殖力显著降低(P0.05);克隆形成实验结果也显示,与NC组CNE2Z细胞克隆数(106±3.21)比较,shRNA-ATF5组细胞克隆数(10±2.08)显著减少(P0.05)。(3)划痕实验结果显示,NC组CNE2Z细胞4 h迁移率为(0.52±0.05),8 h迁移率为(0.74±0.07);shRNA-ATF5组细胞4 h迁移率为(0.17±0.04),8 h迁移率为(0.18±0.06),shRNA-ATF5组细胞迁移能力较NC组明显降低(P0.05);Transwell迁移实验结果也显示,shRNA-ATF5组迁移细胞数量(2±0.23)明显低于NC组迁移细胞数量(111±1.99)(P0.05);侵袭实验结果显示,shRNA-ATF5组侵袭细胞量(4±1.45)明显低于NC组侵袭细胞数量(132±9.79)(P0.05)。(4)IPA分析结果显示,ATF5相关的下游通路有HGF信号通路、TGF-β信号通路、IL-6信号通路及ILK信号通路被抑制,以ILK信号通路抑制最为显著,Z-score为-2.111。(5)Westorn blot分析显示,shRNA-ATF5组CNE2Z细胞E-cadherin表达水平较Control组及NC组显著升高,而N-cadherin、Viminetine、MMP9表达量却显著降低(P0.05),shRNA-ATF5组CNE2Z细胞ILK和p-GSK3β(Ser-9)表达水平均较Control组及NC组也显著降低(P0.05),总GSK3β表达水平无明显变化(P0.05);而ATF5过表达组CNE2Z细胞ILK和p-GSK3β(Ser-9)表达水平均较Control组及NC组明显升高(P0.05),总GSK3β表达水平也无明显变化(P0.05)。结论:(1)ATF5能促进鼻咽癌细胞的增殖,及增强鼻咽癌细胞的侵袭力和迁移力。(2)ATF5高表达能上调E-cadherin蛋白表达,上调N-cadherin、Vimentin及MMP9表达,提示ATF5沉默可能诱导鼻咽癌细胞EMT。(3)ATF5可能通过激活ILK/GSKβ信号通路诱导鼻咽癌细胞EMT而增强鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力。
【学位授予单位】:遵义医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:R739.63

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