重组腺相关病毒介导TGF-β_1基因修饰脂肪干细胞成软骨细胞的研究

袁小洪

【摘要】： 目的：利用重组腺相关病毒载体转染ADSCs;研究重组腺相关病毒介导TGF-β1基因修饰ADSCs后,诱导其向软骨细胞分化；为软骨组织工程提供了一种新的诱导方法。方法：选取6月龄新西兰大白兔,取颈背部脂肪组织约3g,分离提取ADSCs并传代培养。选用第3代ADSCs进行转染。转染分3组：分别为TGF-β1载体组(rAAV2-TGFβ1-IRES-EGFP转染)、空载体组(rAAV2-EGFP转染)和空白组。选择感染复数为5×105,转染时间为90min,转染后用丁酸钠促进目的基因表达,采用半量换液的方法进行培养,隔日换液,并收集每次换出的培养液。转染24h后开始观察细胞,每日在倒置显微镜下观察细胞形态、增殖情况；并隔日在荧光显微镜下观察荧光细胞的数量和荧光强度。计算转染效率(转染率=每个视野的荧光细胞数/细胞总数)。利用MTT法检测重组腺相关病毒转染对ADSCs增殖能力的影响。对转染后收集到的培养液进行ELISA法检测TGF-β1浓度。分别对转染14天和21天的细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色和糖胺聚糖甲苯胺兰染色。结果：从脂肪组织中成功分离提取出ADSCs,并进行了传代培养。细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。观察到TGF-β1载体组和空载体组有较多荧光细胞,而空白组至始至终没有荧光细胞。通过MTT法检测,说明重组腺相关病毒转染对ADSCs增殖能力短期内没有影响。转染14天和21天后,TGF-β1载体组免疫组化染色观察到Ⅱ型胶原染色,甲苯胺兰染色观察到糖胺聚糖染色。结论：运用重组腺相关病毒载体成功转染ADSCs,且转染率很高,对细胞毒性小,但基因表达需用增强剂辅助。重组腺相关病毒介导TGF-β1基因转染后,ADSCs成功向软骨细胞分化。通过基因转染使诱导因子表达更加稳定、持久、可靠,诱导因子浓度较低。

【关键词】：干细胞 组织工程 腺相关病毒 转染 Ⅱ型胶原
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329
【目录】：

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