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《贵阳中医学院》 2010年
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青蒿鳖甲汤干预BMSCs对AML-CR患者BMNC来源DCs诱导的影响

孙晶晶  
【摘要】: 目的:本实验以体外培养的方法,将达到完全缓解标准的急性髓细胞白血病患者骨髓中分离出去T细胞的骨髓单个核细胞(TD-BMNC)、BMSCs分别与青蒿鳖甲汤含药血清培养,再将与含药血清共同培养过的TD-BMNC来源的DCs与BMSCs共同培养,观察含药血清对树突状细胞(DC)分化成熟的影响。用此法诱导分化的树突状细胞(DC)与纯化的正常人和缓解期患者外周血T细胞共同培养,得到激发T细胞,用激发的T细胞与白血病细胞株(K562)共同培育,以MTT法测定该T细胞对K562细胞株的杀伤活性,探讨青蒿鳖甲汤能否通过干预AML-CR患者BMSCs从而对其骨髓单个核细胞来源的DC诱导作用产生影响。 方法:1.应用洗涤细胞、离心程序在AML-CR患者的骨髓中分离出BMSCs,加入青蒿鳖甲汤不同剂量含药血清组的25cm2培养瓶中,放置在37℃,5%CO2条件下培养,于接种3d后首次半量换液,以后隔日换液,在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况并拍照;2.应用绵羊红细胞玫瑰花结程序从AML-CR患者骨髓中分离出去T细胞的骨髓单个核细胞(TD-BMNC),用含10%FBS的RPMI1640培养液调整TD- BMNC细胞浓度后加入24孔板中培养,培养9d,隔日换液1次,以不同浓度中药含药血清、中药含药血清联合细胞因子(GM-CSF、IL-4、TNF-α)、细胞因子、空白血清组分别培养;在培养过程中观察细胞的形态,并拍照。3.用FITC标记的CD29、CD44及CD-1a、HLA-DR、CD86抗体分别标记BMSCs及DCs,用流式细胞仪检测各组各抗体的表达率。4.收集培养9d后的BMSCs与DCs,用RPMI1640调整细胞浓度至1X106/ml混合培养5d;5.分别收集纯化的同种异体T细胞、AML-CR患者自体T细胞、BMSCs与AML-CR患者TD-BMNC来源的DC以10:1比例加入24孔培养板培养5d,培养基中加入100U/ml的IL-2进行同种异体T细胞及自体T细胞的激发。6.激发后的各组T细胞与K562细胞分别以10:1、20:1、40:1效:靶比例培养24h,MTT法检测不同条件培养的DC诱导T细胞的杀伤效应。 结果: 1.用倒置显微镜观察发现青蒿鳖甲汤含药血清组、含药血清联合细胞因子组、细胞因子组BMSCs、DC的形态无差别。 2.从BMSCs的免疫分子检测显示,AML-CR患者骨髓基质细胞经青蒿鳖甲汤含药血清培养可获得具备典型特征和细胞表型的BMSCs,含药血清与细胞因子在诱导CD29、CD44表达方面无协同作用,是否细胞因子对BMSCs的分化无影响,是否对兔子内环境有干预作用,均有待于进一步研究。 3.从DC的免疫分子检测显示,AML-CR患者骨髓单个核细胞经青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获得具备典型特征和细胞表型的DC。从本实验的总的趋势看,青蒿鳖甲汤含药血清配合细胞因子培养诱导DC,其特异性表面抗原的表达高于青蒿鳖甲汤含药血清及细胞因子培养诱导的DC,说明细胞因子和青蒿鳖甲汤含药血清在诱导TD-BMNC转化DC上有协同作用,可能为含药血清改善了细胞因子的功能和内环境,促进了DC的诱导、分化。 4.在本实验中,各组激活T细胞对K562细胞均有杀伤作用,各效靶比中各组别对K562细胞的杀伤率普遍优于空白组;表明青蒿鳖甲汤干预的含药血清诱导的DC有效的提呈了肿瘤抗原;并活化T细胞,致使它成为抗原特异性的CTL,能够特异性的杀伤K562肿瘤细胞。青蒿鳖甲汤与细胞因子有协同作用,可能青蒿鳖甲汤含药血清诱导、强化的骨髓基质细胞分泌了多种的细胞因子,这些因子改变了机体的内环境,最终影响了DC细胞对K562的杀伤作用;从实验数据来看异体T细胞杀伤率优于自体的T细胞的杀伤率,可能是白血病肿瘤免疫逃逸机制主要是白血病缓解后患者T细胞的细胞毒功能受损严重有关,有待进一步大样本实验研究。各组别对K562细胞均有杀伤作用,但就本实验而言,效靶比与杀伤率之间没有一定的规律可循,这与文献报道的杀伤作用随效靶比的增加而增加不符,有待以后的实验进一步研究。 5.从本实验数据看,青蒿鳖甲汤含药血清低剂量组培养诱导BMSCs、DC的特异性细胞表面抗原表达率高于中、高剂量组,抗原表达不因剂量增加而升高,说明低剂量青蒿鳖甲汤含药血清可能是此项实验的最佳浓度,但是在各组激活T细胞对K562细胞的杀伤作用中,青蒿鳖甲汤低、中、高剂量之间的却无一定规律可循,因此低剂量青蒿鳖甲汤含药血清是否为最佳浓度仍有待于进一步研究。 结论: 1.急性髓系白血病完全缓解患者骨髓经青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获得具备典型特征和细胞表型的BMSCs。 2.急性髓系白血病完全缓解患者TD-BMNC经青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获得具备典型特征和细胞表型的DCs。 3.经青蒿鳖甲汤含药血清干预的BMSCs影响TD-BMNC来源的DCs后,DCs激活的T淋巴细胞能够特异性杀伤K562肿瘤细胞。
【学位授予单位】:贵阳中医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

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