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《云南大学》 2010年
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丽江云杉体胚发生体系优化及体胚发育过程蛋白质组分析

陈少瑜  
【摘要】:体细胞胚胎发生是植物无性繁殖的重要途径之一,在理论研究和实践应用上皆有重大意义。然而,由于树种的特性,在林木类群中占有非常重要地位的针叶树种的体胚发生被认为是难度最大的,其中云杉属树种的体胚发生相对易于成功,因而成为针叶树种体胚发生研究的模式树种。 丽江云杉(Picea likiangensis (Franch.) Pritz),松科云杉属常绿乔木,是云南有分布的云杉属的唯一树种,具有一定的经济效益和生态价值。本研究以丽江云杉成熟合子胚为外植体,在初步建立体胚发生体系基础上,进一步进行体系优化。另外,研究对非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织及不同发育阶段体胚进行组织细胞学和蛋白质组分析,揭示了各组织材料的细胞组织结构特征和差异蛋白及变化情况,质谱鉴定并探讨了部分特异蛋白。具体研究内容及研究结果如下: 1.在初步建立的丽江云杉体胚发生体系基础上,从胚性愈伤组织的保存、体胚成熟以及体胚发育的同步化调控3个方面进行了体胚发生体系优化的研究。 获得胚性愈伤组织更有效的继代保存方法。丽江云杉胚性愈伤组织在与胚性愈伤诱导相同的培养基(1/2LM+2,4-D3.0mg/L+BA1.5mg/L, pH5.8)中继代(10~14天继代1次),继代6个月的胚性愈伤组织大多丧失体胚再生能力,于1/2LM+2,4-D1.0mg/L+BA1.5mg/L中继代6个月的胚性愈伤组织仍保持体胚再生能力。 确定更高效的体胚成熟培养方法。丽江云杉的胚性愈伤组织在培养基1/2LM+ABA20-80mg/L+PEG7.5%中经球型胚、心形胚、鱼雷胚发育成子叶胚。研究表明,不同的ABA浓度产生子叶胚的数量和质量不同,40mg/L-60mg/L的ABA浓度具有较好的体胚成熟效果。在相同的培养条件下,同一家系不同细胞系体胚成熟的数量和质量不尽相同。 体胚发育得到同步化调控。通过激素以及培养时间的调节进行丽江云杉体胚发育同步化调控。将生长旺盛的胚性愈伤组织转入1/2LM+2,4-D0.2mg/L+ABA6omg/L+蔗糖40g/L中培养15天,继代1-2次,可获得高度同步化球型胚;将同步化球型胚转入培养基1/2LM+ABA60mg/L+蔗糖40g/L,20天得到鱼雷胚,再经15天得到同步化子叶胚。 2.对丽江云杉的愈伤组织及不同发育阶段体胚进行了形态特征观察和石蜡切片组织细胞学研究,同时揭示了淀粉粒的变化。 愈伤组织的形态及组织细胞学特征:丽江云杉合子胚经诱导产生2类型3种形态的愈伤组织,类型Ⅰ为非胚性愈伤组织,有绿色坚硬状和黄色疏松颗粒状2种形态,此类愈伤组织增殖较慢,长期继代后逐渐枯黄,无体胚再生能力;类型Ⅱ为胚性愈伤组织,松散、白色透明丝状,此类愈伤组织增殖较快,在增殖培养基中可长期旺盛增殖和生长,有体胚再生能力。在细胞结构上,非胚性愈伤组织的细胞体积大,核小,胞质稀,细胞的形状和排列不规则,细胞分裂能力弱。胚性愈伤组织则显示了针叶树种特有的胚性胚柄团结构。 不同发育阶段体胚的形态及组织细胞学特征:转接到体胚成熟培养基后,胚性愈伤组织由丝状透明逐渐变为非透明,胚性胚柄团的头部显著增大,由浅黄色圆球状,经纵向伸长,发育成可以看到子叶的黄色子叶胚。组织细胞学观察,胚性愈伤组织具有明显的胚性胚柄团结构特征,转入体胚成熟培养基后,胚性胚柄团的胚细胞分裂旺盛,胚细胞团增大,胚柄细胞则开始退化。在体胚发育的过程中,始终可见胚性细胞排列紧密、细胞核大、核仁明显、细胞分裂旺盛。球型胚阶段的胚性细胞开始有细胞的分化,随着体胚发育的进程,可见胚性细胞排列逐渐规则而且更加紧密,两级的出现以及维管组织和分生组织的逐步形成。 淀粉粒的动态变化:淀粉是植物体内最普遍的一类贮藏物质,其分布的多少和部位可以作为细胞分化的一个标志,其消长与植物的形态建成密切相关。丽江云杉体胚发育过程中,有两次淀粉粒的积累,一次是具有分化能力的胚性愈伤组织形成阶段的淀粉粒积累,另一次是球型胚到心形胚阶段的淀粉粒积累,其中心形胚时期是淀粉粒最为富集的阶段。 3.采用蛋白质组学方法和技术对丽江云杉非胚性愈伤组织(NEC)、胚性愈伤组织(EC1)及不同发育阶段体胚:球型胚(EC2)、鱼雷胚(EC3)和子叶胚(EC4)共5个材料进行了蛋白质组研究。 建立了丽江云杉蛋白质组研究的实验体系。体系包括TCA/丙酮法的蛋白质提取以及稳定的、高效率的蛋白质等点聚焦双向电泳分离及染色技术体系。 愈伤组织及不同发育阶段体胚蛋白质种类丰富。图像分析表明5个材料分离到了数量较多的蛋白点,各材料蛋白总数分别为:NEC:1857个;EC1:1999个;EC2:2344个;EC3:2285个;EC4:2205个。蛋白质大多分布在MW20-66KD,pH4-7区域。 体胚发育过程差异蛋白变化显著。5个材料间差异蛋白分析表明各材料大部分主要蛋白质组分没有发生变化,说明蛋白质组的相对稳定性,同时它们之间又存在蛋白组分差异,主要表现在蛋白表达丰度的变化以及特异蛋白的出现,3倍(以上)差异蛋白59个,特异蛋白44个。其中以子叶胚阶段(EC4)的差异蛋白变化最为显著,鱼雷胚阶段(EC3)上调蛋白和新出现的特异蛋白所占此阶段差异蛋白的比例最大,而且多为小分子量蛋白。 部分特异蛋白的质谱鉴定。在44个特异蛋白中选取15个蛋白进行了MALDI-TOP/MS质谱鉴定及NCSInr数据库查询,其中7个蛋白为阳性。它们分别为:NEC中表达的PPR家族蛋白,对细胞器基因的表达具有重要的调节作用;ECl中表达的B-羟脂酰-ACP脱水酶b,与脂肪酸的合成密切相关;在EC2中出现的R2R3-MYB转录因子,调控植物次生代谢、细胞形态发生、激素刺激和环境胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等;EC3中出现的假想蛋白OsI 00337,属于AP2/EREBP转录因子,具有调节植物对激素、病原和胁迫等应答反应的功能;以及3个在Picea sitchensis研究中发现,但还未知功能的蛋白。 研究结果为丽江云杉的无性繁殖和进一步的遗传育种奠定基础,为进一步分离、纯化与体胚发育密切相关基因的特异蛋白、克隆相关基因以及从细胞和分子水平揭示植物体细胞胚胎发生的机理提供参考。
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