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《云南大学》 2012年
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嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)镉耐性机制研究

湛方栋  
【摘要】:铅锌矿产资源的开采导致铅锌矿区镉(Cd)严重污染,是云南省重大环境问题之一。在Cd严重污染的铅锌矿区自然生长的野生植物根部普遍定殖着深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes, DSE),提示着DSE在铅锌矿区野生植物适应重金属胁迫中可能发挥着重要作用。研究分离自铅锌矿区的DSE对Cd的耐性及其机理,有助于阐明DSE在重金属严重污染的铅锌矿区这一特殊生态系统中的功能地位,解释铅锌矿区DSE与野生植物重金属耐性的关系;对于探索利用植物根部定殖的DSE,提高植物耐受重金属能力,重建重金属污染环境植被具有重要的理论和实践意义。 本研究以分离自重金属严重污染的云南省会泽铅锌矿区自然生长的密序野古草(Arundinella bengalensis (Spreng.) Druce)根内的1株DSE真菌—嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)为研究对象,浓度为0-400mg/L的Cd胁迫处理下,研究菌丝Cd富集量、Cd化学形态与亚细胞分布、细胞壁Cd吸附能力与特征、Cd吸附基团、菌丝黑色素性质与特征、低分子量有机酸分泌、矿质营养、抗氧化系统等方面的内容,分析该菌株耐受Cd的胞外与胞内机制,得到以下主要结果: (1) E. pisciphila ACCC32496有很强的Cd耐性和富集能力。固体和液体培养情况下,采用直线内插法计算Cd对E. pisciphila ACCC32496的半数生长抑制浓度值(EC50),分别为332.2和111.2mg/L。Cd浓度为400mg/L时,E. pisciphila ACCC32496菌丝的Cd含量达到51.43mg/g干菌丝。 (2)采用扫描电镜—能谱、透射电镜和透射电镜—能谱分析,结合差速离心法分离E. pisciphila ACCC32496菌丝亚细胞组分(细胞壁、细胞器和可溶性组分),发现Cd主要分布在菌丝细胞壁上。采用化学试剂逐步提取法,研究表明菌丝Cd的化学形态主要为醋酸提取态(FHAc)和氯化钠提取态(FNaCl)。 (3)0.1M HCl和Na2EDTA从E. pisciphila ACCC32496菌丝解吸出来的Cd占菌丝Cd含量的63.0%-83.5%,0.1M CaCl2能够解吸8.3%-43.8%,0.1M NaOH能够解吸0.9%-5.6%。 (4)在初始Cd浓度为25~400mg/L, pH值5.0,转速120rpm和30℃条件下, E. pisciphila ACCC32496菌丝吸附Cd的过程符合Langmuir吸附等温模型,吸附Cd的动力学实验数据符合准二级速率方程。傅里叶红外光谱(FTIR)分析表明,吸附Cd的化学基团涉及氨基、酰氨基、羧基、羟基和磷酰基等。 (5) E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素属于典型的DHN型黑色素。三环唑能特异性抑制E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素合成,浓度不高于10μg/ml的三环唑对E. pisciphila ACCC32496菌丝生长与孢子产生量没有明显影响。Cd浓度在50-350mg/L, E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素含量有显著增加。50~200mg/L Cd胁迫下,采用三环唑抑制E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素合成,该菌丝生物量显著小于正常菌丝,Cd富集量大于正常菌丝,表明黑色素在该菌株Cd耐性中有作用。 (6)Cd胁迫导致E. pisciphila ACCC32496菌丝N、K和Fe含量显著下降,P、Mg和Ca含量显著增加,S含量在Cd浓度为100mg/L时显著增加。Cd胁迫促进E. pisciphila ACCC32496菌丝产酸,培养液pH值下降。采用高效液相色谱法(HPLC)分析培养液中的低分子量有机酸,表明E. pisciphila ACCC32496菌丝主要产生草酸,培养液中菌丝草酸分泌量随Cd处理浓度增加而显著增加。 (7)Cd胁迫导致E. pisciphila ACCC32496菌丝超氧阴离子生成速率、MDA和H2O2含量显著增加。SOD酶与CAT酶活性、GSH与-SH化合物含量以及T-AOC在一定Cd浓度范围内,随着Cd浓度增加而增强。 以上结果表明,分离自重金属污染严重的铅锌矿区的DSE菌株E. pisciphila ACCC32496对Cd有很强的耐性与富集能力。E. pisciphila ACCC32496对Cd的耐性机制:①胞外机制包括:增加低分子量有机酸的分泌,尤其是草酸的分泌;通过菌丝细胞壁对的Cd吸附作用,以及增加细胞壁上的特殊组分—黑色素的合成。②胞内机制包括:通过增强菌丝细胞内SOD, CAT等抗氧化酶的活性,增加GSH等巯基化合物的合成,以及提高菌丝中P, S、Mg和Ca等矿质元素的含量,提高E. pisciphila ACCC32496对Cd的耐受能力。 本文通过铅锌矿区典型DSE菌株对Cd的富集特征和耐性机制的初步研究,有助于理解特殊生境—重金属严重污染的铅锌矿区中特殊生物类群—DSE的生态学功能,并为进一步研究DSE在重金属污染环境的植被重建与修复可能应用打下了一定的基础。
【学位授予单位】:云南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:X174

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