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《云南大学》 2016年
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人脐带来源间充质干细胞(MSCs)的分离生产技术优化及应用

余鹏程  
【摘要】:细胞替代治疗(Cell Replacement Therapy)已经成为再生医学领域的热点,其中人脐带来源间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUC-MSCs)的临床研究及应用尤为突出。目前针对hUC-MSCs的分离培养方法各有优缺点,获得的细胞质量也千差万别,因此如何获得相对可靠、安全及优质的hUC-MSCs已经成为细胞分离生产技术上的重要问题。本研究建立一种新的分离方法一优化的组织爬片法,该种方法可以高效获得优质的hUC-MSCs。对比其他三种常见的分离方法如传统酶解法、大块组织贴壁法和传统组织爬片法分别从人脐带中分离得到间充质干细胞,结果显示优化的组织爬片法:(1)操作简单,分离时间可缩短至1h左右,省去了剔除血管、酶消化等繁琐的步骤;(2)只需1cm脐带就可分离出较多细胞,细胞形态好,细胞得率是其他三种方法的3-10倍;(3)原代细胞生长用时较短(8d左右),优于传统组织爬片法(10d左右)和大块组织贴壁法(11d左右),一般传代至P1或P2代即可纯化;(4)所得细胞活率(94.98±0.51%)明显高于传统酶解法(85.02±0.90%)。应用流式细胞仪对四种方法获取的细胞进行免疫表型鉴定,显示高表达CD29、CD44、CD73、 CD90、CD105,不表达或低表达CD34、CD45、CD31、CD40,符合间充质干细胞的免疫表型。在实际细胞生产过程中应用优化的组织爬片法处理了1028例脐带标本,建立了hUC-MSCs分离、培养、冷冻、检测等生产技术流程,同时优化的组织爬片法处理标本在试剂、耗材及设备等方面成本较低,对企业建库而言可省下一笔不小的开支。综上所述优化的组织爬片法是一种简单、高效、低成本分离hUC-MSCs的方法,而且更易建立和规范标准操作规程和质量控制标准,为企业投资建立大规模细胞产业化生产节约成本,为建立符合国际标准的储存自体和异体的间充质干细胞库做好充分的技术准备,同时也为hUC-MSCs在细胞替代治疗、组织工程、器官移植等再生医学领域的深入研究提供一种更为安全的种子细胞来源。
【关键词】:人脐带间充质干细胞 优化的组织爬片法 免疫表型 标准操作规程 种子细胞
【学位授予单位】:云南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R329.2
【目录】:
  • 中文摘要3-4
  • Abstract4-9
  • 第一章 前言9-16
  • 1. 干细胞分类9-10
  • 2. 间充质干细胞的生物学特性10-12
  • 3. 间充质干细胞的临床应用12-13
  • 4. 脐带来源间充质干细胞的分离方法13-16
  • 第二章 优化的组织爬片法分离技术的建立16-49
  • 1. 实验材料16-19
  • 1.1 脐带的来源16
  • 1.2 仪器与设备16-17
  • 1.3 主要耗材及器械17
  • 1.4 主要试剂17-19
  • 2. 总的技术路线19
  • 3. 实验方法19-33
  • 3.1 主要试剂配制19-20
  • 3.2 脐带采集处理20
  • 3.3 脐带原代细胞分离20-30
  • 3.4 细胞体外培养传代及细胞计数30-31
  • 3.5 细胞冻存与复苏31
  • 3.6 细胞复苏活性检测31-32
  • 3.7 细胞增殖生长曲线32
  • 3.8 流式细胞仪检测细胞表面标志32
  • 3.9 数据处理32-33
  • 4. 实验结果与分析33-48
  • 4.1. 原代细胞形态比较33-35
  • 4.2 原代细胞生长用时及细胞得率比较35-36
  • 4.3 细胞纯化代数及细胞活率比较36-37
  • 4.4 细胞生长增值曲线比较37-42
  • 4.5 细胞表型检测42-48
  • 5. 小结48-49
  • 第三章 优化的组织爬片法在实际细胞生产中的应用49-68
  • 1. 实验材料49-52
  • 1.1 脐带的来源49-51
  • 1.2 仪器与设备51
  • 1.3 主要耗材及器械51
  • 1.4 主要试剂51-52
  • 2. 实验方法52-59
  • 2.1 脐带接收登记52
  • 2.2 脐带原代细胞分离52
  • 2.3 细胞体外培养扩增52
  • 2.4 细胞冻存及细胞计数52-53
  • 2.5 无菌检测53
  • 2.6 支原体检测53-54
  • 2.7 免疫学检测54-58
  • 2.8 细胞表型检测58-59
  • 3. 实验结果59-67
  • 3.1 采集处理例数分布59
  • 3.2 冻存细胞代数及细胞数量59-60
  • 3.3 细胞活率60-61
  • 3.4 无菌检测结果61
  • 3.5 支原体检测结果61-63
  • 3.6 免疫学检测结果63-66
  • 3.7 流式检测结果66-67
  • 4. 小结67-68
  • 第四章 讨论68-74
  • 结论74-75
  • 附录75-77
  • 参考文献77-85
  • 致谢85

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