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《云南大学》 2003年
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食线虫真菌侵染性胞外蛋白酶的基因克隆与表达

赵明莲  
【摘要】:全球每年由植物寄生线虫对农作物造成的损失在1000 亿美元以上(Sasser Freekman, 1987), 要成功有效地防治寄生线虫,必须对侵染机制的分子背景有清楚的认识和了解。食线虫真菌的侵染毒力是提高线虫生物防治效果的关键。通过真菌侵染线虫相关酶基因的克隆和表达是解决这一关键问题的有效途径,对揭示真菌与线虫的识别、侵染的分子机制和生防实际应用都具有重要科学意义和应用前景。 本文选取了不同代表类型的侵染线虫真菌,对这些真菌侵染靶标线虫过程中的关键酶进行了深入研究。建立了以线虫生测为指标筛选高活力侵染酶的技术路线,完成了侵染性胞外蛋白酶的分离纯化、性质鉴定和N-末端氨基酸序列分析,成功地克隆了不同代表类型真菌的侵染性蛋白酶cDNA 基因,其中1 个基因是首次报道;完成了一种碱性蛋白酶基因的异源系统表达和表达产物的免疫学鉴定,并进行了功能分析。该研究初步揭示了真菌侵染线虫的机制,丰富了食线虫真菌侵染宿主过程中的致病毒力因子--侵染性胞外丝氨酸类蛋白酶的性质及其酶基因结构特征的知识,为获得侵染线虫的高毒力工程菌株奠定了坚实的理论基础。 主要结果为: ⑴纯化分析了三种真菌蛋白酶(SWISS-PROT 序列号)、克隆了两种蛋白酶相应的cDNA 基因序列(Genbank 序列号): ? P83290 : 来源于捕食线虫真菌寡孢节丛孢( Arthrobotrys oligospora ),其发酵液离心后,通过硫酸铵沉淀、阴离子交换和凝胶过滤柱层析等步骤分离获得电泳纯的中性蛋白酶(定名为Aoz1),其分子量为38kDa,等电点pI 为pH 4.9, 反应最适温度为45℃,最适pH 为6.0-8.0。测定的N-末端氨基酸序列为:NH2-A-E-Q-T-D-S-T-W-G-L-D-R-I-S-H-E-D-Y -S-A。NCBI-BLASTP 分析,其与PII 蛋白酶接近氨基末端的一段序列完全一致。根据氨基末端序列推导设计了三条简并引物(简并度均为256),应用3’RACE 技术克隆了编码Aoz1 成熟肽的cDNA 基因;应用SMART-RACE技术克隆了其调控区序列,从而获得含有帽子结构和Poly(dA)尾巴的全长
【学位授予单位】:云南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S476

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