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《云南大学》 2010年
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微囊藻毒素-LR酶联免疫法的开发研究

张爱  
【摘要】： 酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)建立于1971年,并用于医学研究。微囊藻毒素的ELISA分析国外应用得早一些,国内也有应用,但不如国外成熟。本文以微囊藻毒素-LR的酶联免疫分析作为探讨对象,内容包括微囊藻的毒素-LR的提取与纯化、微囊藻毒素-LR的完全抗原化、以及微囊藻毒素-LR单克隆抗体细胞株的筛选培养。 (1)通过对从滇池捞取的新鲜藻样过筛选取、冷冻干燥制得蓝藻藻粉;用醋酸溶液破坏蓝藻细胞壁,使藻毒素溢出细胞;通过C18柱子的浓缩富集作用,用80%的甲醇溶液洗脱并收集藻毒素的提取液;对藻毒素提取液进行液相色谱分离分析,确定MC-LR保留时间为30min～31min,收集MC-LR分离液,浓缩、过C18柱纯化MC-LR,得到MC-LR粗提取液,在荧光硅胶薄层板的进一步精密分离下,得到MC-LR精制样品;通过液相色谱-质谱仪(LC-MS)鉴定,采用外标法计算,得到纯度为98.79%的MC-LR精制样品。本试验一共提取MC-LR精制样品6.4mg。 (2)MC-LR的分子量为995.2D,是典型的半抗原。在免疫反应过程中,只有反应性没有免疫原性,为使MC-LR具有免疫原性,我们利用蛋白质的偶联技术,使其在动物免疫的过程中产生有效的免疫应答。本文首先用二巯基乙胺活化MC-LR,在MC-LR的第七位氨基酸脱氢丙氨酸的双键位置引入一个氨基,然后选用分子量为67000D的牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,通过戊二醛两步法使MC-LR与BSA得到耦联。通过生物质朴法对中间产物H2N-etMC-LR的分子量进行了鉴定,确定MC-LR的活化很成功;分别通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质朴(MALDI-TOF-MS)检测,对偶联物MC-LR-BSA进行定性、定量鉴定。结果显示,耦联比在3～18:1之间,平均耦联比为8:1。 (3)选用已鉴定的MC-LR-BSA免疫Balb/c实验小鼠,按100ug/只进行腹腔注射,加强免疫3～5次,每隔两周加强免疫一次,得到了效价为接近1:25600的血清。采用杂交瘤技术,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,用HAT选择性培养基进行选择培养,利用间接ELISA法筛选阳性细胞孔,将筛选出的阳性细胞进行细胞克隆欲获得稳定的细胞株,扩大培养。运用间接ELISA法测定MC-LR的最适包被浓度为10ng～20ng/孔。
【关键词】：微囊藻毒素-LR 提取 纯化 完全抗原 杂交瘤技术 酶联免疫吸附(ELISA)
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R115
【目录】：
  • 中文摘要3-5
  • 英文摘要5-10
  • 1 前言10-23
  • 1.1 问题的提出10-11
  • 1.2 现状及国内研究背景11-19
  • 1.2.1 微囊藻毒素及污染现状11-13
  • 1.2.2 研究背景13-19
  • 1.2.2.1 微囊藻毒素提取的研究现状13-16
  • 1.2.2.1.1 破损蓝藻细胞的方法13-14
  • 1.2.2.1.2 溶剂萃取的主要体系14
  • 1.2.2.1.3 固相萃取（SPE）14-15
  • 1.2.2.1.4 固相微萃取（SPME）15
  • 1.2.2.1.5 分离技术15-16
  • 1.2.2.2 国内外微囊藻毒素分析方法进展16-17
  • 1.2.2.3 酶联免疫检测在微囊藻毒素检测方法中的应用进展17-19
  • 1.2.2.3.1 ELISA 及检测过程中的关键问题17-18
  • 1.2.2.3.2 ELISA 的改进和发展18-19
  • 1.3 研究意义19-20
  • 1.3.1 各级环境监测站都有检测需要19-20
  • 1.3.2 目前应用的HPLC 法――高价设备、前处理要求高、标准试剂品费用高20
  • 1.3.3 ELISA 法简单易行，可作为是否实施HPLC 的前期试验20
  • 1.4 研究难点20-22
  • 1.5 技术路线22-23
  • 2 材料与方法23-35
  • 2.1 材料23-25
  • 2.1.1 实验仪器设备及耗材23
  • 2.1.2 SDS-PAGE 电泳缓冲液准备23-24
  • 2.1.3 ELISA 主要试剂配制24
  • 2.1.4 细胞培养试剂系统24-25
  • 2.1.5 实验动物及细胞25
  • 2.2 方法25-35
  • 2.2.1 MC-LR 的提取与纯化25-26
  • 2.2.1.1 蓝藻样品的收集与预处理25
  • 2.2.1.2 初步分离 MC-LR 色谱条件25
  • 2.2.1.3 MC-LR 的纯化25-26
  • 2.2.1.4 MC-LR 的鉴定及纯度测定26
  • 2.2.2 完全抗原的合成26-29
  • 2.2.2.1 合成原理26-27
  • 2.2.2.1.1 MC-LR 完全抗原的人工合成26-27
  • 2.2.2.1.2 产物的纯化及鉴定27
  • 2.2.2.2 试验操作的具体过程27-29
  • 2.2.2.2.1 微囊藻毒素的氨基活化27
  • 2.2.2.2.2 戊二醛两步法合成微囊藻毒素完全抗原27-29
  • 2.2.3 微囊藻毒素-LR 单克隆抗体细胞株系的研究29-35
  • 2.2.3.1 实验原理29
  • 2.2.3.2 动物免疫29-30
  • 2.2.3.3 细胞融合30-32
  • 2.2.3.3.1 骨髓瘤细胞的复苏与培养30-31
  • 2.2.3.3.2 饲养细胞的制备31
  • 2.2.3.3.3 细胞融合方法及具体步骤31-32
  • 2.2.3.4 观察细胞生长情况32
  • 2.2.3.5 杂交瘤细胞的筛选32-33
  • 2.2.3.5.1 阳性细胞孔的筛选32
  • 2.2.3.5.2 阳性细胞孔的进一步筛选32-33
  • 2.2.3.5.3 阳性杂交瘤细胞的克隆和扩大培养33
  • 2.2.3.5.4 细胞的冻存33
  • 2.2.3.6 ELISA 检测方法的建立33-35
  • 2.2.3.6.1 包被抗原最适浓度的确定33-34
  • 2.2.3.6.2 血清效价的测定34-35
  • 3 实验结果与分析35-49
  • 3.1 MC-LR 提取与分离实验结果35-40
  • 3.1.1 初步分离MC-LR 色谱条件35-36
  • 3.1.2 MC-LR 的鉴定结果36-39
  • 3.1.2.1 MC-LR 定性鉴定结果36-38
  • 3.1.2.2 MC-LR 纯度鉴定结果38-39
  • 3.1.2.3 MC-LR 提取总量39
  • 3.1.3 小结39-40
  • 3.2 MC-LR 人工抗原的鉴定及结果40-44
  • 3.2.1 H2N-etMC-LR 的鉴定及结果40
  • 3.2.2 微囊藻毒素完全抗原的定性鉴定40-41
  • 3.2.3 微囊藻毒素完全抗原的定量鉴定41
  • 3.2.4 微囊藻毒素完全抗原研制的讨论41-44
  • 3.2.4.1 MC-LR 的氨基衍生化41-42
  • 3.2.4.2 戊二醛两步法合成微囊藻毒素人工抗原42
  • 3.2.4.3 完全抗原的鉴定42-44
  • 3.3 微囊藻毒素-LR 单克隆抗体细胞株系建立的结果44-49
  • 3.3.1 包被抗原最适浓度的确定44-45
  • 3.3.2 血清抗体效价的测定45
  • 3.3.3 杂交瘤细胞株的建立45-47
  • 3.3.3.1 阳性细胞孔的筛选45-47
  • 3.3.3.2 阳性孔细胞的克隆和细胞保存47
  • 3.3.4 小结与讨论47-49
  • 3.3.4.1 包被抗原最适浓度的确定47
  • 3.3.4.2 血清抗体效价的测定47-48
  • 3.3.4.3 杂交瘤细胞株的建立48-49
  • 4 结论49-51
  • 5 总结与展望51-53
  • 参考文献53-59
  • 致谢59

【参考文献】
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