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《昆明理工大学》 2010年
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观赏植物吸收代谢甲醛及其甲醛胁迫响应基因的研究

梅岩  
【摘要】:由于各种绝热建筑材料在建筑物上的应用,使得甲醛成为室内空气的主要污染物之一。用观赏植物来净化室内甲醛,是一种简便易行、长期有效的生态治理方法。科学研究已证实植物能吸收代谢甲醛,但植物甲醛代谢的遗传工程研究仍处于刚刚起步阶段,对植物代谢甲醛的机理仍缺乏了解。因此有必要开展这方面的研究,以便从植物自身的代谢策略中获得线索和依据,科学地开展甲醛污染的植物修复工作。 本研究以几种观赏植物为材料,测定它们吸收甲醛的能力,并分析了影响观赏植物吸收甲醛的因素。通过14C-甲醛标记实验分析检测4种观赏植物同化和代谢甲醛的能力,通过13C-甲醛标记实验以及甲醛胁迫处理后氨基酸含量的分析对2种植物代谢甲醛的机制进行初步分析,从而推导其代谢途径。此外,还检测了甲醛胁迫条件下3种观赏植物总蛋白、可溶性糖和丙二醛含量等生理指标的变化情况,对观赏植物响应甲醛的生理机理进行初步探讨。为了从分子水平上了解观赏植物应对甲醛胁迫的分子机理,构建了万年青在甲醛胁迫下正向SSH cDNA文库,对其甲醛胁迫条件下的基因差异表达进行分析,还构建了大花蕙兰Smart cDNA文库,并通过RT-PCR方法对其甲醛胁迫下的一些基因的表达谱分析进行研究。主要取得了以下结果: 1.秋海棠(Begonia semperflorens)镜面草(Pilea peperomioides)、牵牛花(Petunia hybrida)、万年青(Rohdea japonica)和凤尾蕨(Pteris multifida Poir)对7mM液体甲醛的吸收能力由强到弱分别为:万年青、牵牛花、凤尾蕨、秋海棠和镜面草。大花蕙兰(Cymbidium grandifiorium)、万年青、喜林芋(Philodendron pandurifor)和常春藤(Caulis Hederae Sinensis)对2mM液体甲醛的吸收能力由强到弱分别为:万年青、常春藤、大花蕙兰和喜林芋。 2.观赏植物吸收甲醛的能力受环境因子和植物叶片表面微生物的影响。低温(15℃)和偏碱环境(pH 9.0)可能会影响观赏植物对甲醛的吸收。叶片表面的微生物对观赏植物吸收甲醛有一定的贡献,且它们对甲醛吸收贡献的大小取决于植物叶片的表面结构。 3.万年青、常春藤、大花蕙兰和喜林芋同化14C-甲醛的能力从强到弱依次为:大花蕙兰、万年青、喜林芋、常春藤。四种植物经14C-甲醛处理24h后可溶性部分的14C同位素活性高于不溶性部分,更多的14C活性出现在植物的可溶性部分。 4.13C甲醛和13C甲醇标记大花蕙兰、万年青、喜林芋和常春藤24h后,可溶性部分的13C NMR谱说明四种观赏植物代谢甲醛和代谢甲醇的途径是不相同。13C甲醛时间梯度标记大花蕙兰和万年青的13C NMR谱表明大花蕙兰和万年青代谢甲醛的途径可能相同,甲醛一部分直接可能与四氢叶酸结合生成5,10-亚甲基四氢叶酸,进而代谢成丝氨酸,小部分代谢成甲酸,随后可能被分解为二氧化碳或代谢成5,10-亚甲基四氢叶酸,再形成丝氨酸。丝氨酸可能进入光呼吸途径,然后同化进入各种可溶性糖分子中,但是甲醛的代谢并没有产生甲醇。 5.大花蕙兰、万年青、喜林芋经2mM甲醛处理后氨基酸含量发生了很大的变化。大花蕙兰中Glu的含量先下降然后急剧上升,Asp有大幅度的上升,而Ser也有明显的增加。万年青的Asp含量在前12h急剧上升之后又急剧下降,Glu含量先下降后上升,Ser只有轻微的上升。喜林芋中Glu的含量在处理2h后急剧下降至最低然后上升,至12h再下降至最低,而His的含量在处理2h后剧裂下降然后呈平缓上升的趋势,Ser有明显增加的趋势。 6.大花蕙兰、万年青、喜林芋经甲醛处理后植物体内一些生理指标发生了变化。其中,蛋白含量的变化趋势为先下降,后上升,说明甲醛胁迫开始时,蛋白质合成减少,有部分蛋白质可能被分解或消耗;可溶性糖和丙二醛的含量在甲醛处理初期均显著增加,说明甲醛的胁迫使膜质发生过氧化作用,为了提高甲醛脱毒能力,糖类的合成量增加。 7.利用抑制消减杂交技术构建2mM甲醛胁迫下万年青叶片的正向SSH cDNA文库,文库包含1248个阳性克隆。PCR检测发现文库插入片段大小主要分布在200-800bp之间,呈随机分布,平均的插入片段大小约500bP左右。 8.从SSH cDNA文库中选出插入片段大于500bp的克隆进行测序,对测序结果分析后获得了296个EST序列,已知功能的EST序列占61%,其中12%与代谢和能量相关,与胁迫防御相关的有10%,与蛋白合成和加工相关的占9%,信号转导为7%,转运蛋白和转录调控各占6%,光合作用和细胞骨架相关的各为3%,与蛋白降解及细胞生长相关的各为2%;功能未知的EST序列占18%;获得的新基因占21%。 9.通过RT-PCR分析验证文库中18个基因的表达谱,结果表明这些基因在甲醛胁迫均为上调表达。万年青用2mM甲醛处理后丙二醛的含量很高,说明甲醛处理后产生很强的氧化胁迫,与此对应的是文库中很多胁迫防御相关基因如胁迫蛋白,热激蛋白,硫氧还蛋白,谷氧还蛋白,氧化还原酶等的表达均被上调,从而利于保护细胞不受氧化胁迫的损伤,增强其对甲醛的脱毒能力。 10.采用Smart技术构建了大花蕙兰叶片Smart cDNA文库,文库含有672个阳性克隆的。PCR检测发现文库插入片段大小主要分布在200-800 bp之间,呈随机分布,平均的插入片段大小约500bP左右。从Smart cDNA文库中选出插入片段大于500bp的136个克隆进行测序分析后,获得了95个EST序列。 11.通过RT-PCR分析大花蕙兰Smart cDNA文库中15个基因的表达谱,结果发现受甲醛胁迫后上调表达的基因为:衰老相关蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶B亚基、LHcⅡ型叶绿素a/b结合蛋白、热激蛋白、L-同型天冬氨酸-0-甲基转移酶;受甲醛胁迫后下调表达的基因为:叶绿素a/b结合蛋白、胁迫响应蛋白、铁氧还蛋白还原酶、光系统Ⅰ亚基Ⅳ、原叶绿素还原酶B和前质体蓝素,可见甲醛胁迫对大花蕙兰中光合作用相关的很多基因的表达都有抑制作用。
【学位授予单位】:昆明理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S68

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