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《昆明理工大学》 2011年
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云南省GBV-C流行与进化特征及其自身清除机制的研究

冯悦  
【摘要】:庚型肝炎病毒(GB virus C, GBV-C)发现于二十世纪九十年代中期,属于黄病毒科、单股正链RNA病毒,基因组全长约9.4kb。GBV-C与艾滋病病毒(HIV-1)、丙型肝炎病毒(HCV)具有几乎相同传播途径,在HIV/HCV单/共感染的静脉吸毒人群(IDUs)中广泛传播。根据基因序列同源性,目前GBV-C可分为六种基因型,各基因型具有典型的地域分布特征。GBV-C病毒感染者无典型的临床症状,但该病毒在与HIV-1共感染情况下,具有延缓艾滋病病程、抑制艾滋病病毒复制的作用,此作用与GBV-C基因型及相关基因序列特征具有较大的相关性。云南省地处我国西南边陲,与东南亚多国接壤,毗邻全球最大的毒品生产地——金三角地区,是毒品运输的重要途径。多项研究表明,血缘性病毒的传播途径和毒品运输路径直接相关,云南省因此成为HIV-1和HCV传入我国,并向其他省份传播的源头地区,在云南地区开展血缘传播病毒的分子流行病学研究显得尤为重要。在云南省开展开展GBV-C的分子流行病学,及在与HIV-1共感染情况下的疾病慢性化机制研究具有较大的科学意义和潜在应用价值。 为调查云南地区GBV-C的感染情况,我们首先对该地区231例静脉吸毒者和非静脉吸毒者的GBV-C感染情况进行检测,发现GBV-C E2抗体检测阳性率为25.97%(60/231),GBV-C RNA检测阳性率为32.04%(74/231),抗体/核酸交叉阳性率仅2.16%(5/231)。在静脉吸毒人群中GBV-C/HIV/HCV的三重感染率明显高于GBV-C单感染和GBV-C/HCV的共感染(P0.05);在非静脉吸毒人群中,GBV-C/HCV的共感染率明显高于GBV-C/HIV/HCV三重感染率(P0.05);GBV-C在HIV轻症和重症的患者中的感染率明显高于在HIV中症患者的感染(P0.05)。为验证GBV-C对HIV-1和HCV感染者病程的影响,本研究对GBV-C感染与患者的CD4细胞数、ALT、AST、HCV的基因型和亚型、HIV-1 RNA病毒载量和HCV RNA病毒载量等相关指标的相关性进行了分析,GBV-C感染与否,以上指标未发现显著变化。 为阐明GBV-C阳性患者中GBV-C基因型流行特点,本研究进而对GBV-C RNA阳性样本的GBV-C 5'NCR、E2基因及病毒全基因进行扩增、序列测定与同源关系分析,发现43例GBV-C感染者中除1例(NK07)属于3型,2例(DH019和DH021)属于4型外,其它40例所感染毒株不属于已知基因型且独立成簇。Bootstrap值分别为:5'NCR,97%;E2,99%;Full-length,99%。全基因组核苷酸序列分析结果显示,新基因型序列间相似性为91.2%-99.2%,不同基因型间相似性为86.2%-89%,Simplot和Bootscanning分析表明,所有获得新基因型全基因组序列不存在型间重组现象,该毒株可被命名为GBV-C7型。基于现有数据,云南省GBV-C基因型分布为:7型占93.02%(40/43)、4型占4.65%(2/43)、3型仅占2.33%(1/43);在IDU人群中,7型为93.10%(27/29)、4型为6.90%(2/29)、没有发现3型的存在;在非IDU人群中,7型为92.86%(13/14)、3型为7.14%(1/14)、未发现4型的存在。鉴于GBV-C基因分型尚无公认方法和界定标准,本研究提出了以GBV-C E2区序列为主要分型靶序列,平均遗传距离小于0.0900视为同一基因型,介于0.1282~0.1438之间可视为不同基因型,平均遗传距离介于0.0900~0.1282之间时,该毒株可能为基因重组型或者同一种基因型,需经重组位点分析确定。 为揭示GBV-C起源与进化,本研究分别根据GBV-C全长基因组序列、5NCR、E1、E2和NS5B区的核酸序列变异情况,对GBV-C进化速率和可能起源时间进行推算,所得的GBV-C分子进化速率为10-5~10-2sub/site/year,推断GBV-C的起源时间为152.96~1798.76年以前。比较而言,病毒E1/E2区(nt 900-1250)核酸序列更适合用于GBV-C的起源与进化研究,以此序列计算得到GBV-C五种基因型的分子进化速率介于10-4~10-2sub/site/year之间。根据各基因型病毒的地域分布、变异率和进化速率推断其起源时间和可能起源地,发现GBV-C 1型起源于非洲西部(1238年)、GBV-C 2型起源于欧洲(1928年)、3型起源于日本(1987年)、4型起源于东南亚(1981年)、5型起源于非洲南部(1975年)。总结我国主要GBV-C流行株的进化和传播特点为,GBV-C 3型由日本传播至中国,GBV-C 4型由东南亚分别经云南地区传播至中国内陆地区。在云南省,GBV-C 4型可能以东南亚国家接壤的德宏地区、红河地区和文山地区为源头,传播到云南省中部地区(大理和昆明地区),再经中部地区向我国内陆地区的传播。 最后,为了探索GBV-C的自身高清除率的相关机制,本论文就宿主细胞microRNA对GBV-C复制的影响进行了研究。利用生物学相关软件以GBV-C 3'NCR为靶基因预测了机体内相关的rnicroRNA共计12种,从中筛选出最可能与GBV-C 3'NCR发生作用的三种microRNA,即Has-miR148a、Has-miR-152和Has-miR-301。进而,建立了此三种microRNA的茎环RT-PCR和SYBR染料的荧光定量PCR的检测方法,以及GBV-C 3'NCR和三种microRNA的真核表达体系。研究结果表明,高表达miR-148a的Huh7.5.1细胞中,GBV-C 3'NCR基因的表达量明显下降。然而,经RNAi技术抑制miR-148a表达的细胞中,GBV-C 3'NCR基因表达量明显上调。由此我们得出,Has-miR-148a与GBV-C 3'NCR之间呈负相关的生物学特性。 综上所述,本论文通过对云南省不同人群和不同地区中GBV-C的感染、基因型流行、起源进化以及高清除率的相关机制的研究发现,GBV-C在云南地区高度流行且发现了新的基因型并命名为GBV-C 7型,提出了以E2区序列为基础的基因型分型的新标准;通过对GBV-C起源与进化的研究,阐明了我国和云南地区的GBV-C基因型进化特点和传播路径;证明了Has-miR-148a与GBV-C高清除率的相关性。本论文针对云南地区GBV-C的研究为首次,为今后在该地区开展相关研究提供了第一手资料,并为GBV-C和HIV共感染相关方面的研究提供了前瞻性的建议,同时为GBV-C影响HIV患者疾病进程的研究提供了参考和理论依据。
【学位授予单位】:昆明理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R181.3

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