黑大豆响应酸性土壤和铝胁迫及甲醇促进其在酸性土壤上生长的生理特性和基因转录水平的变化研究

【摘要】：全球可耕地面积约30%为酸性土壤,这些酸性土壤主要分布在发展中国家的热带、亚热带及温带地区。酸性土壤上有多种植物生长的障碍因子,铝毒害是酸性土壤中作物生长的主要限制因子之一。本研究以酸性土壤和铝胁迫耐受型黑大豆(丹波黑大豆,简称RB)和酸性土壤和铝胁迫敏感型黑大豆(简称SB)为材料,在生理水平和转录水平上分析这两种大豆响应铝胁迫和酸性土壤些的生理基础和分子机理,主要结果如下： 在不同浓度铝胁迫下,RB叶和根中的H202和MDA上升幅度低于SB,SB的叶和根中膜脂过氧化程度大于RB。在不同浓度铝胁迫下,RB叶和根中的超氧化物歧化酶(SOD)活性与SB差异不大,而过氧化氢酶(CAT)活性在RB和SB的叶和根中均被诱导显著升高,过氧化物酶(POD)活性在RB叶和根中有下降趋势但仍然显著高于SB。因此,与酸敏感型的SB相比,耐酸型RB在铝胁迫下有较强的保护酶活性,使其在铝胁迫下膜脂受氧化损伤的程度低于SB,抗氧化酶系统在RB抗铝机制中发挥重要作用。 在50μM铝胁迫不同时间后,RB和SB叶和根中均发生氧化胁迫,SB的氧化胁迫程度明显比RB严重。RB叶和根中CAT活性对铝胁迫响应的速度快于SB: RB叶和根中POD活性随着铝胁迫时间的增加上升趋势比SB明显；RB和SB叶和根中SOD活性对铝胁迫无响应。表达谱分析结果表明,在铝胁迫期间,RB叶中有高水平POD的表达,而SB叶中POD未表达,RB根中POD的表达水平也明显高于SB；两种SOD的表达在RB中表现上升趋势,而在SB中为下调趋势,且在RB中的表达水平也高于SB。以上研究结果表明,RB不仅具有高水平的抗氧化酶体系,且该体系中抗氧化酶基因可被铝胁迫诱导上调,因而迅速增强其抗氧化胁迫的能力,这可能是RB应答铝毒的一个重要机制。 用组成型启动子(CaMV35S)驱动丹波黑大豆中Δ8鞘脂类去饱和酶基因在烟草中过量表达,验证该基因的功能。实验结果表明：在30μM铝处理24h后,野生型烟草的根相对伸长量为43%,而3株转基因株系根相对伸长量为70-72%,是野生型烟草的1.63-1.67倍,说明过量表达Δ8鞘脂类去饱和酶可以提高转基因烟草的耐铝能力。在铝胁迫下,野生型烟草根部的H2O2含量都高于转基因株系；并且MDA含量高于转基因株系,是转基因株系的1.64-1.78倍,说明过量表达Δ8鞘脂类去饱和酶可以降低转基因烟草中铝诱导的膜脂过氧化作用。 在水培条件下研究铝胁迫影响植物生长的机理是一种理想化的试验条件,为了更好地理解RB应答酸性土壤胁迫的分子机制,本研究用大豆DNA芯片技术鉴定RB适应酸性土壤胁迫的响应基因。结果表明,RB根中共有1729个基因的表达受酸性土壤胁迫的影响,其中上调基因(1021)是下调基因(708)的1.4倍。RT-PCR的分析结果表明在酸性土壤胁迫下RB中上调表达的基因,在SB中的表达量低于RB或者呈下调表达。多个酸性磷酸酶基因的上调表达可能增加RB根适应酸性土壤低磷胁迫的能力。铝诱导基因如Sali3-2、Sali5-4a和铝诱导蛋白以及抗铝基因如ABC通道蛋白和醛脱氢酶基因的上调表达可能增强RB根吸收铝的区室化作用并降低酸性土壤胁迫诱导的膜脂过氧化作用。低磷和铝诱导表达的基因如MATE和质膜H+-ATPase也被酸性土壤胁迫强烈诱导,这可能显著增强酸性土壤胁迫下RB根尖柠檬酸的分泌能力。与细胞壁结构相关的基因如蔗糖-UDP糖基转移酶基因和木葡聚糖内糖基转移酶基因等的上调表达可能参与调节RB适应酸性土壤胁迫生长过程中细胞壁的僵硬化作用。病原相关基因、热休克蛋白基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因、硫氧还蛋白基因、GST和Fe-SOD的诱导表达可能使RB根在酸性土壤下的抗病和抗氧化胁迫能力增强。参与信号转导途径的调控基因如磷脂酶2C基因、钙依赖的蛋白激酶基因和钙调素类(CaM)基因的上调表达可能参与调节RB根中其他效应基因应答酸性土壤胁迫的过程。此外,与类黄酮代谢相关基因如香豆素-CoA连接酶、香豆素-CoA还原酶、香豆素-CoA-O-甲基转移酶,类黄酮-3-脱氢酶等相关基因的下调表达可能是分子水平上酸性土壤胁迫对RB毒害作用的表现。因此通过磷素吸收、柠檬酸分泌、抗氧化和病原胁迫、铝的区室化等相关基因的表达可能是RB应对酸性土壤胁迫的主要分子机制。 甲醇的应用可以促进很多植物的生长,并能缓解干旱胁迫对棉花和大豆生长的影响,为了探讨甲醇的应用是否可以缓解酸性土壤胁迫对黑大豆生长的影响,本研究用5%甲醇喷施到生长在中性土壤、红壤和黄壤的RB叶面上,结果表明叶面喷施5%的甲醇使生长在中性土壤、红壤、黄壤中的RB茎节长度增加,株高增加的幅度分别为21%、22%、23%。5%甲醇处理对生长在三种土壤中的RB叶片相对叶绿素含量无显著影响,对中性土壤和红壤中生长的RB鲜重和干重的影响都不明显,但增加黄壤中生长的RB叶片鲜重和干重,使其分别达到对照的1.94倍和1.98倍。在三种土壤中生长的RB叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量对5%甲醇处理不同时间有不同的响应模式。叶面喷施5%甲醇对黄壤中RB生长的促进作用比较显著,可能和甲醇增加其叶片可溶性蛋白和可溶性糖的持续合成有关。这些研究结果说明叶面喷施5%甲醇可能是缓解酸性土壤胁迫影响植物生长的一个有效措施。 为了在分子水平上更好地理解喷施5%甲醇促进酸性土壤上RB生长的机理,本研究应用cDNA芯片鉴定叶面喷施5%的甲醇后RB叶片中的甲醇应答基因。结果鉴定得到516个可能的甲醇响应基因,其中上调基因和下调基因的数目分别为190和326。芯片数据显示甲醇喷施叶片后,6个POD基因及其它抗氧化胁迫相关基因上调表达,这可能是甲醇的应用缓解酸性土壤胁迫影响RB生长的分子机理之一。此外甲醇通过上调3种CaM的表达及它们与不同靶蛋白的相互作用在转录水平和蛋白水平上影响很多基因的功能,调控RB的生长和发育。2个赤霉素相关基因,2个生长素相关基因的表达也被甲醇上调。甲醇处理可能通过改变这些激素相关基因的表达水平,从而改变这些激素在RB植株中的分布和水平,增加RB植株茎节及叶片的生长。RT-PCR分析结果证实RB叶片用甲醇处理后CabP、ChOS, PSISVI, RCA等光合作用相关基因的表达谱均呈上调模式,说明甲醇通过刺激光合作用相关基因的表达,提高RB的光合作用能力,从而增加叶片生物量的积累。