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《昆明理工大学》 2017年
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基于抑癌基因启动子的环境遗传毒性筛选系统的建立及其在抗肿瘤药物筛选中的应用

陆思千  
【摘要】:癌症是人类复杂疾病中最难攻克的一种,目前我国的癌症发病率持续上升,恶性肿瘤已经成为致死率最高的疾病。癌症的发生和发展是遗传因素和环境因素共同作用的结果,环境因素包括多种化学致癌物、物理辐射、微生物类如病毒感染等,遗传因素则包括原癌基因的激活及抑癌基因的突变或表达被抑制导致其功能丢失或降低。在攻克癌症的道路上,各国科学家致力于抑癌基因的研究和探索,通过充分了解其作用机制进而尝试对其进行多方面的调控,从而完成对肿瘤的抑制。在众多抑癌基因中,p53作为最重要的抑癌基因之一,在肿瘤抑制中发挥重要作用。p53通过周期阻滞完成对DNA损伤的修复,在修复无法完成时诱导细胞凋亡和衰老,进而抑制肿瘤的发生和发展。在多种恶性肿瘤中p53水平很低,其表达水平受到多种因素的调控,其中转录水平的调控是基因表达的关键环节。基因转录水平的升高离不开上游转录因子对其启动子的转录激活,因此我们利用p53基因启动子特有的DNA损伤感应能力,克隆了p53基因核心启动子在内的起始密码子上游约750bp的序列,并构建了以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的遗传毒性筛选系统。该系统能对环境中的多种化合物进行高通量筛选,快速鉴别出具有遗传毒性的化合物。除了遗传毒性筛选之外,有研究证明在p53基因未突变的肿瘤细胞中再激活p53可以有效抑制肿瘤的发展甚至诱导肿瘤消退,因此我们预期可以通过该筛选系统对多种天然提取化合物进行筛选,以期筛选到以p53基因启动子作为靶点的低毒性抗肿瘤药物。除了 p53这一重要的抑癌基因外,研究发现在多种恶性肿瘤中存在抑癌基因Ink4a/ARF的变异,包括基因的纯合性缺失、杂合性缺失、突变以及启动子甲基化等。p16和p19蛋白功能分别属于Rb和p53信号途径,在监控细胞周期,抑制肿瘤发生等过程中起到了重要作用。有研究证明p16Ink4a基因的表达异常和恶性肿瘤的发生和发展有关,例如在黑色素瘤中经常发现p16Ink4a基因启动子甲基化导致的基因沉默。而ARF基因被证明能被多种原癌基因激活信号所激活,通过p53介导的肿瘤抑制对抗癌症的发生和发展。因此我们同样构建了以GFP作为报告基因,分别以p16Ink4a和p19ARF基因的启动子区域作为靶点的抗肿瘤药物筛选系统,以期能够筛选到能够有效激活Ink4a/ARF)基因启动子的低毒性抗肿瘤天然化合物。在本研究中,我们选择的第四代启动子报告载体pGL4.82是在前几代的基础上进行了改良,减少了过多的转录因子结合位点并提高了其在细胞内表达的稳定性。为了提高检测效率,我们将载体上的荧光素酶报告基因替换为GFP,这样我们可以通过荧光显微镜对报告基因进行快速观察,构建得到的载体命名为pGL4-GFP。随后我们将上面三种重要的抑癌基因启动子构建入载体,并稳定转染到遗传背景清晰的细胞系里,通过抗性筛选得到基于三种抑癌基因启动子的稳定筛选细胞系 p53-GFP,p16-GFP 和 p19-GFP。筛选系统建立后,我们首先对p53-GFP细胞系功能进行验证:对p53-GFP筛选系统我们选择了阿霉素、环磷酰胺、顺铂、苯并芘等DNA毒性剂进行测试。在阿霉素处理6h后就可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,且随着药物处理时间的增加,荧光强度逐步升高,在24h时达到高峰,而阴性对照则没有观察GFP表达。其他几种DNA毒性剂也观察到了相同的结果,蛋白免疫印迹确证了 GFP蛋白的表达。这一实验证明了该系统可以有效响应DNA损伤,因此我们可以将其应用于环境遗传毒性化合物的监测。同时,临床上使用的大量癌症化疗药物都属于DNA损伤剂,这些药物对于活跃增殖的正常细胞,如骨髓造血细胞、小肠上皮细胞等具有较大的杀伤,从而普遍存在药物毒副作用较强的问题。我们构建的这一高通量筛选系统是基于p53启动子的转录激活,因此我们预期能够筛选到能有效激活抑癌基因表达同时细胞毒性较弱的天然化合物。接下来,我们应用该系统筛选了多种天然化合物包括昆明植物研究所提供的升麻类提取物及黄杨类生物碱。结果表明,多种升麻类提取物均不能有效激活p53启动子,对野生型MEF细胞的毒性也较小。而黄杨生物碱化合物中有部分化合物如 KBA01、KBA02、KBA03、KBA07、KBR11 等能有效激活 GFP 表达,为了寻找到细胞毒性较低,又能在细胞内再激活p53的天然化合物,我们进一步将这些筛选出的化合物对野生型MEF细胞进行了处理,均有效升高了 p53水平。随后我们对这些化合物处理后的细胞形态进行拍摄并通过流式细胞仪对细胞凋亡水平和周期分布进行检测,发现其中多数化合物均对细胞增殖产生了抑制,且凋亡细胞明显增多,例如KBA03诱导了细胞G1期的阻滞,KBR18处理后凋亡细胞明显增多。大多数筛选出的黄杨生物碱均带有不同程度的基因毒性,但我们发现其中的KBA07能有效激活p53基因启动子,且不具有明显的遗传毒性,其处理后的野生型MEF细胞在周期和凋亡水平与对照均没有显著差异。我们认为该化合物可能是通过p53基因上游的某些转录因子的激活或相互作用激活了p5 基因启动子,但本身并不具有强遗传毒性,对KBA07需要进一步研究其作用机制。在实验室之前的普洱茶抗肿瘤机制的研究中,我们发现普洱茶能显著提高p16的mRNA水平,用普洱茶对p16-GFP细胞进行处理后,能观察到报告基因GFP的表达升高,证明普洱茶是通过作用于p16Ink4p基因启动子激活了 p16的表达,但并不存在剂量效应。在多种恶性肿瘤中均发现p16的失活,因此能激活p16启动子的化合物就具备一定的抗肿瘤潜能。我们用该系统筛出了如升麻提取物KY01、KY40等能有效激活p16的化合物,对它们的作用机制还需要进一步研究。在验证p19-GFP筛选系统时,我们对该筛选系统转染了 pBabe-RasG12V外源表达载体,过表达的RasG12V能有效激活p1p基因启动子,在转染后24h就观察到明显的GFP表达。之前有研究证明p19基因启动子对原癌基因激活信号敏感且存在特异性,这一特质也是该基因启动子的宝贵特点,区别于p53会被多种损伤信号激活从而有可能造成过度应激。通过对多种化合物进行筛选也发现鲜有能激活p19启动子的化合物,但我们欣喜的发现KBA07能有效激活p19启动子,从而我们觉得KBA07具有较高的研究价值。为了进一步研究KBA07的作用机制,我们用KBA07处理了野生型MEF细胞和多种遗传背景清晰的肿瘤细胞系,发现p53和p1p基因的转录水平明显升高,但升高的p53并没有激活其下游分子p21,证明其并不具备强遗传毒性,其对p53的激活主要是通过升高其转录水平。在p53为野生型的Hela细胞进行KBA07处理后,观察到p53升高,对细胞增殖产生了抑制。当KBA07与阿霉素和顺铂联合使用时对细胞增殖的抑制更为明显,提示我们KBA07可能可以作为一种化疗的辅助药物,通过提高细胞内的p53蛋白本底水平,并在DNA毒性剂作用下,快速激发细胞阻滞、凋亡和衰老进而完成肿瘤细胞的抑制和清除。为了进一步研究KBA07对p53基因启动子的作用机制,我们通过数据库预测和查询找到了 10个位于p53启动子的转录因子结合位点,通过人工合成这些转录因子结合序列并转染到p53-GFP细胞中,从而和启动子序列产生竞争抑制。研究发现在转入了NF-κB与HIF-1这两种转录因子结合序列的p53-GFP细胞中,KBA07对报告基因的转录激活受到了明显抑制,证明KBA07的作用机制可能与这两个转录因子有关。通过蛋白免疫印迹证明KBA07能有效激活HIF-1,进一步的研究还在进行中。综上所述,我们构建了分别基于三种重要的抑癌基因p53、Ink4a、ARF启动子的以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因的稳定筛选细胞系p53-GFP,p16-GFP和p19-GFP,并对这三个筛选系统进行了验证实验,证明了它们能够快速、特异性的对作用于这三种抑癌基因的启动子的天然化合物小分子产生响应。该系统能对环境中的遗传毒性物质进行快速筛选并能对多种化合物或小分子进行筛选,快速找到靶向性明确的具有抗肿瘤潜力的化合物,对于抗肿瘤药物的开发具有重要意义。同时我们筛选出了一些有抗肿瘤潜力的化合物例如黄杨生物碱KBA07,并将其进一步处理多种遗传背景清晰的肿瘤细胞,对其抗肿瘤活性进行研究,证明了其抗肿瘤潜力。同时通过针对p53基因启动子的转录因子结合序列竞争实验,对KBA07的分子机制进行了初探。
【学位授予单位】:昆明理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q523

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