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《云南农业大学》 2017年
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云南传统酸乳清中乳酸菌多样性及其益生特性研究

王昱敬  
【摘要】:酸乳清经乳清自然发酵,是云南传统乳制品(如乳饼、乳扇)加工的天然凝乳剂。传统酸乳清制作工艺独特,加之云南自然环境的多样性,使得其中蕴藏的乳酸菌资源极为丰富,是筛选具有益生功能乳酸菌的天然宝库。本研究基于高通量Illumina MiSeq测序平台,利用双末端测序(Paired-End)的方法,对德宏州、昆明市、大理州、香格里拉市的18份酸乳清中16S rRNA序列进行测定,与SILVA数据库进行比较,分析酸乳清中细菌群落多样性及各分类水平的细菌组成。对其中蕴含的乳酸菌采用传统纯培养方法进行了分离,利用生理生化实验和基因序列分析等方法对分离株进行鉴定和保藏,通过绘制乳酸菌系统发育树,探索其进化途径和亲缘关系,并对乳酸菌分离株的胃肠道耐受性、人结肠癌细胞HT-29的黏附性与食源性致病菌抑菌能力等益生特性进行了研究,结果如下:1.乳酸菌的多样性高通量测序表明,酸乳清样品主要包括7个门、38个细菌属,厚壁菌门(Firmicutes)为优势门,其中乳酸杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的基因序列相对丰度占酸乳清中细菌总数的68.98%和7.73%,为细菌群落的优势属。采用Simpson和Shannon指数对样品细菌多样性指数分析发现,德宏州样品生物多样性最高,分别为0.16±0.03、2.30±0.21,香格里拉样品细菌群落多样性最低,分别为0.84±0.12、0.31±0.17,不同地区酸乳清样品中菌群具有显著差异(P0.05)。从低海拔、气候环境相对温和的德宏州到中高海拔的昆明市和大理州,再到高海拔、气候相对寒冷的香格里拉酸乳清中发现乳杆菌属随着海拔的升高逐渐增多,乳球菌属随着海拔的升高逐渐减少。此外,云南传统发酵酸乳清中含有少量的葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、不动杆菌(Acinetobacter)和无色杆菌(Achromobacter)等致病菌。2.乳酸菌的分离鉴定云南传统酸乳清中共分离得到47株乳酸菌,归类为4个属(Enteroccoccus、Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus)中的12个种,包括22株Enterococcus faecium、6株Lactobacillus fermentum、4株Pediococcus acidilactici、3株Enterococcus durans、3株Lactobacillus reuterii、2株Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、2株Streptococcus gallolyticus、1株Pediococcus pentosaceus、1株Lactobacillus oris、1株Streptococcus macedonicus、1株Lactobacillus pontis和1株Lactobacillus plantarum。Enterococcus faecium是传统酸乳清中的优势菌,占总分离株的46.81%。3.乳酸菌的益生特性(1)模拟胃液条件下(pH 2.0)培养2h,再经模拟小肠液环境(胰酶0.1%、胆盐0.3%)作用2h,供试菌株L1-6、K2-3、K3-1、D1-2、L5-1、K2-4、D1-1、K1-2、L1-2、D2-2、X1-1、L6-3、X2-2、D2-1、L1-3、L3-1、L5-2、D3-3、D3-2、D3-4和L2-1共21株保持了较高的存活率,活菌数≥5 log cfu/mL,具有良好的胃肠道耐受性,在肠道定殖的潜力巨大。(2)对HT-29人结肠癌细胞黏附能力表明,屎肠球菌(Enterococcus faecium)K2-4黏附率为24.12%,黏附力最强。与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG黏附能力比较,其中12株乳酸菌分离株黏附力较强(P0.05)。(3)对食源性致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌)的抑菌结果,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)D3-2,德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)D1-1,戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)D2-2,屎肠球菌(Enterococcus faecium)K2-4、L2-1和L6-3具有较好的抑菌效果(抑菌圈6mm),广谱抑菌。此外,乳酸菌分离株上清液抑菌效果优于菌体。本文揭示了云南省传统酸乳清中乳酸菌多样性,收集了优势乳酸菌种资源,并对其益生特性评价,为发酵乳制品的开发利用提供科学依据。
【学位授予单位】:云南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TS252.1

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