ERK1/2信号转导通路在β-TC-6细胞葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应中的作用

【摘要】：第一部分胰岛β细胞系β-TC-6的培养、生物学特性及葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的研究 目的探讨胰岛β细胞系β-TC-6的培养方法、生物学特性及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌反应。方法观察β-TC-6细胞培养时间内的形态变化及其增殖、生长规律；分别以0mM、1.38mM、5.5mM、11.1mM葡萄糖刺激β-TC-6细胞的胰岛素分泌(GSIS),用放免法检测细胞上清液中的胰岛素浓度。结果培养过程中β-TC-6细胞生长状态良好呈多角形,传代48小时后进入增殖生长期；β-TC-6细胞在含0.1%BSA的KRBH液中孵育630分钟,1.38mM葡萄糖刺激时胰岛素分泌达高峰,5.5 mM、11.1 mM葡萄糖刺激时胰岛素分泌较1.38mM时下降。结论β-TC-6细胞生长状态良好,增殖能力强,并保持了β细胞的生物学特性,其最适宜的葡萄糖刺激浓度为1.38mM。 第二部分葡萄糖刺激活化β-TC-6细胞ERK1/2信号转导通路的研究 目的探讨葡萄糖刺激下β-TC-6细胞ERK1/2信号转导通路磷酸化水平的变化。方法1、β-TC-6细胞接种于6孔板,48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养2小时,再在含0mM、1.38mM、5.5mM、11.1mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育5分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法检测磷酸化ERK1/2的水平。2、β-TC-6细胞接种于6孔板,48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养2小时,再在含1.38mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育0分钟、5分钟、15分钟、30分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法检测磷酸化ERK1/2的水平。结果1、β-TC-6细胞在1.38mM葡萄糖刺激时ERK1/2磷酸化水平达高峰,5.5 mM、11.1 mM葡萄糖刺激时ERK1/2磷酸化水平较无葡萄糖刺激时升高,但较1.38mM葡萄糖刺激时下降。2、β-TC-6细胞在1.38mM葡萄糖刺激5分钟时ERK1/2磷酸化水平达高峰,随着刺激时间的延长ERK1/2磷酸化水平逐渐下降,30分钟时ERK1/2磷酸化水平下降到无葡萄糖刺激时水平。结论葡萄糖刺激可活化β-TC-6细胞ERK1/2信号转导通路。 第三部分ERK1／2信号转导通路在β-TC-6细胞葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应中的作用的研究 目的研究MEK抑制剂PD98059对β-TC-6细胞葡萄糖刺激下ERK1/2信号转导通路及胰岛素分泌功能的影响。方法1、β-TC-6接种于6孔板,47.5小时后加入PD98059(2uM、10uM、50uM)30分钟后,换用无糖KRBH缓冲液培养2小时,再在含1.38mM葡萄糖浓度的KRBH缓冲液中孵育5分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法检测磷酸化ERK1/2的程度。2、β-TC-6接种于24孔板,47.5小时后加入PD98059(2uM、10uM、50uM)30分钟后,换用无糖KRBH缓冲液培养30分钟,再在含1.38mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵60分钟,用放免法检测细胞上清液中胰岛素浓度。结果1、PD98059可抑制p-TC-6细胞葡萄糖刺激下的ERK1/2磷酸化,作用与剂量呈正相关。2、PD98059可抑制β-TC-6细胞葡萄糖刺激下的胰岛素分泌,作用与剂量呈正相关。结论ERK1/2信号转导通路可能在β-TC-6细胞葡萄糖刺激下的胰岛素分泌反应中发挥重要作用。 第四部分炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ对β-TC-6细胞葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响的研究 目的研究炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ对胰岛β细胞株β-TC-6葡萄糖刺激下的胰岛素分泌反应的影响。方法β-TC-6接种于24孔板,24小时后加入IL-1β(0.15ng/ml、1.5ng/ml)和／或IFN-γ(10u/ml、100u/ml),24小时后,换用无糖KRBH缓冲液培养30分钟,再在含0mM或1.38mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育60分钟,用放免法检测细胞上清液中胰岛素浓度。结果IL-1β(0.15ng/ml、1.5ng/ml)或IFN-γ(10u/ml、100u/ml)或联合(IL-1β0.15ng/ml、IFN-γ100u/ml)作用于β-TC-6细胞时胰岛素浓度与单纯葡萄糖刺激组相比均下降,且IL-1β与IFN-γ联合有协同作用。结论IL-1β、IFN-y对β-TC-6细胞葡萄糖刺激下的胰岛素分泌反应有损伤作用。

【关键词】：细胞培养 β-TC-6细胞系 生物学特性 葡萄糖刺激下的胰岛素分泌 细胞外调节蛋白激酶 信号转导 葡萄糖 细胞外调节蛋白激酶 PD98059 葡萄糖刺激下的胰岛素分泌 葡萄糖刺激下的胰岛素分泌 β-TC-6细胞系 炎性细胞因子
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R587.1
【目录】：