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《昆明医学院》 2011年
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ADSCs对人胆管瘢痕成纤维细胞TGF-β/smad信号通路的作用及机制

沈需  
【摘要】：目的： 研究转化生长因子β1 (transforming growth factor, TGF-β1)和人大网膜脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)对体外培养的人良性胆管瘢痕成纤维细胞的作用及可能机制。 方法： 1.人大网膜脂肪间充质干细胞的复苏以及传代培养；2.人良性胆管瘢痕成纤维细胞复苏以及传代培养；3.对培养的人胆管瘢痕成纤维细胞进行不同处理后,进行分组：A组(空白对照组)：人良性胆管瘢痕成纤维细胞；B组(ADSCs干预组)：人良性胆管瘢痕成纤维细胞+诱导分化至第7天的人大网膜脂肪间充质干细胞(用Transwell小室双层培养)；C组(TGFβ1刺激组)：人良性胆管瘢痕成纤维细胞+25ng/ml的TGFβ1孵育；D组(ADSCs干预TGFβ1刺激组)：人良性胆管瘢痕成纤维细胞+25ng/ml的TGFβ1孵育+诱导分化至第7天的人大网膜脂肪间充质干细胞(用Transwell小室双层培养)。4.用Transwell小室双层培养诱导成熟脂肪细胞及胆管瘢痕成纤维细胞,把诱导分化至第7天的人大网膜脂肪间充质干细胞与人良性胆管瘢痕成纤维细胞进行共培养；5.用MTT法等观察人良性胆管瘢痕成纤维细胞ABCD各组生长状况,免疫荧光化学法测定人良性胆管瘢痕成纤维细胞ABCD各组中a-SMA/Ⅰ型胶原/III型胶原的表达,用RT-PCR方法检测定ABCD各组中smad2/smad3/smad4/smad7/a-SMA/Ⅰ型胶原/III型胶原/的mRNA表达。 结果： 1.体外培养的人良性胆管瘢痕成纤维细胞可表达α-SMA,Ⅰ型胶原,III型胶原蛋白； 2. TGF-β1处理的人良性胆管瘢痕成纤维细胞(C组),MTT显示：较A组生长旺盛,RT-PCR显示：a-SMA, I型胶原,III型胶原,smad2/smad3/smad4mRNA的表达较A组增高,smad7mRNA表达量未见明显变化,提示人良性胆管瘢痕成纤维细胞上存在TGFβ-Smad通路,TGF-β1可激活人良性胆管成纤维细胞TGFβ-Smad通路。 3.脂肪细胞干预的胆管成纤维细胞(B组和D组),MTT显示：较A组生长减弱,RT-PCR显示：α-SMA,I型胶原,III型胶原,smad2/smad3/smad4mRNA的表达较A组降低,smad7mRNA表达量未见明显变化,提示人大网膜脂肪间充质干细胞诱导液可抑制人良性胆管瘢痕成纤维细胞的生长,可通过阻断胆管瘢痕成纤维细胞TGFβ/Smad信号通路从而降低其靶蛋白的表达。 结论： 1.体外培养的胆管瘢痕成纤维细胞可表达α-SMA,I型胶原,III型胶原蛋白； 2.TGF-β1可促进体外培养的胆管瘢痕成纤维细胞增殖,并可增强其a-SMA, I型胶原,III型胶原的表达； 3.大网膜脂肪间充质干细胞可抑制体外培养的胆管瘢痕成纤维细胞增殖,并可抑制其a-SMA, I型胶原,III型胶原的表达； 4..大网膜脂肪间充质干细胞可抑制体外培养的胆管瘢痕成纤维细胞增殖,及其a-SMA,I型胶原,III型胶原的表达,可能通过TGF/smad通路发挥作用。
【关键词】：脂肪间充质干细胞 成纤维细胞 TGF-β_1 smad2 smad3 smad4 smad7 诱导分化 RT-PCR
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R657.4
【目录】：
  • 中文摘要6-8
  • Abstract8-10
  • 前言10-14
  • 实验一14-18
  • 1.细胞培养仪器与试剂14-16
  • 2.实验方法:胆管瘤痕成纤维细胞及大网膜脂肪间充质干细胞双层培养16-18
  • 实验二18-20
  • 1.实验材料18
  • 2.实验方法:免疫荧光细胞化学18-20
  • 实验三20-25
  • 1.反转录R-TPCR仪器及试剂20
  • 2.总RNA提取20-21
  • 3.RNA质量鉴定21
  • 4.引物设计与合成21-22
  • 5.半定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR22-25
  • 结果25-36
  • 一 细胞培养结果25-29
  • 二 免疫荧光化学结果29-32
  • 三 R-TPCR结果32-36
  • 讨论36-40
  • 1.大网膜脂肪间充质干细胞的诱导分化36-38
  • 2.TGF一p/smda信号转导通路及其对成纤维细胞生长的影响38-40
  • 结论40-41
  • 参考文献41-44
  • 综述44-50
  • 参考文献47-50
  • 在读期间发表论文50-51
  • 致谢51

【参考文献】
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【共引文献】
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