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《昆明医学院》 2011年
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云南宣威肺癌细胞系侧群细胞特征分析

马丽菊  
【摘要】:[目的]研究云南宣威女性肺癌细胞系中侧群(side population, SP)细胞的生物学特性,了解其中富含的肺癌干细胞样细胞的特征。 [方法]从新建宣威女性肺癌细胞系入手,建系后先进行细胞系的鉴定工作;对新获得的细胞系和原来保有的云南高发肺癌细胞系GLC-82和YTMLC-90,分别进行荧光染料Hoechst 33342(HO)孵育染色,用流式细胞术(flow cytometry,FCM)进行SP细胞表型的分析鉴定;确定在这些细胞系中存在SP细胞后再从中选取最有代表性的细胞系进行SP细胞的荧光激活分选(fluorescence activated cell sorting, FACS)工作,对分选出来的细胞进行细胞生物学行为的研究,着重进行干细胞样特性的相关研究,如软琼脂克隆形成实验、体外侵袭实验、干细胞特性相关基因[ABCG2 (ABC家族中的G2成员)、MDRl(多药耐药蛋白1)、hTERT(端粒酶逆转录酶)、SFTPC(表面活性物质原脱辅基蛋白C)与SCGB1A1 (Clara细胞特异蛋白)]mRNA的Real time RT-PCR检测、分子表面标记物ABCG2、MDR1、CD133、CD44、CD45、CD34的流式细胞检测和microRNA (miRNA或miR)表达谱分析等。把培养后增殖起来的SP细胞再用HO染色行SP再分析,同时对SP细胞采用克隆化培养,分别比较它们的生物学性状(形态学、克隆形成率、增殖特性、细胞周期和DNA倍体)、对抗肿瘤药物的敏感性与BrdU潴留情况,以及干细胞特性相关基因(方法、种类同前)mRNA的表达,异体移植成瘤实验和瘤细胞的SP再分析等。 [结果]新建立了2株宣威女性肺癌细胞系(XLS-06、XLA-07);在这2株细胞系和另2株云南高发肺癌细胞系(GLC-82、YTMLC-90)中均存在SP细胞,其比例分别是XLS-06为0.3%、XLA-07为2.6%、GLC-82为0.9%和YTMLC-90为0.1%;SP细胞处于G0/G1期的比例高于non-SP细胞;SP细胞的体外侵袭力较non-SP细胞为高;SP细胞的克隆形成率为0.02%,而non-SP细胞则未见有效克隆形成;ABCG2、MDR1和CD133蛋白在SP细胞与non-SP细胞分布存在明显差别,SP细胞的表达量高于non-SP细胞,ABCG2和CD133蛋白在SP、non-SP细胞上均有较高表达,MDRl蛋白在2种细胞中的表达均较低;ABCG2、MDR1、hTERT、SFTPC与SCGB1A1基因的mRNA表达量亦是SP细胞高于non-SP细胞;miRNA是一类调节基因表达的非编码小RNA分子,在检测的人848种miRNA中,SP和non-SP细胞的microRNA表达谱明显不同,共有19种miRNA表达有差异,其中在SP细胞中只有3种表达上调,其余均为下调,预测其靶基因发现表达下调者多数是锌指蛋白类、染色体开放阅读框、G-蛋白偶联受体、Dicer酶等等。SP细胞培养后可产生SP与non-SP细胞,SP细胞比例为4.3%,较亲代细胞为高;进一步将SP细胞进行克隆化培养后,得到3种不同形态的细胞,其中一株的超微结构检查显示细胞的分化程度远远低于亲代细胞,这些SP细胞间的倍增时间、克隆形成率、体外侵袭力、细胞周期、DNA倍体、干细胞特性相关基因的表达、对BrdU的潴留程度和异体成瘤能力均不相同,其中的一株SP细胞(命名为XLA-07/SPs)在所做的各种检测中拥有区别于其它株SP细胞的一致的高度恶性性状,它在Balb/c-nu小鼠体内具有成瘤性,瘤组织的病理切片显示出腺癌特征,瘤体细胞SP再分析表明其中SP含量达8%,远远高于亲代细胞,这些特征均较未分选亲代细胞恶性程度为高,呈现出典型的肺癌干细胞的表型和分子特征,因而很可能是一株新的肺癌干细胞。 [结论]在云南高发肺癌细胞系XLS-06、XLA-07、GLC-82和YTMLC-90中存在SP细胞亚群;SP细胞具有较高侵袭性和软琼脂克隆形成率,高表达干细胞特性相关基因和蛋白,microRNA表达谱与non-SP细胞的相比明显不同,共有19种miRNA表达有差别,其中只有3种表达上调,其余16种均为下调,预测其靶基因发现表达下调者多数是锌指蛋白类、染色体开放阅读框、G-蛋白偶联受体、Dicer酶等等,具有肿瘤干细胞样特性;SP细胞是一个异质性群体,含有生物学性状差异很大的细胞;显示干细胞的不对称分裂方式可以采用FCM方法,灵敏度和稳定性均很高的FCM检测细胞对BrdU潴留的现象和数量具有简便、客观、真实、有效等诸多优势;很可能获得了一株宣威女性肺癌干细胞群。
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