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《昆明医学院》 2011年
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BDNF转基因成纤维细胞移植促进脊髓可塑性的分子信号通路研究

孟步亮  
【摘要】:目的建立准确而可靠的成年大鼠脊髓完全横断损伤模型。构建大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的成纤维细胞(FB)。将BDNF基因修饰的FB移植入损伤脊髓内,探讨其对大鼠运动功能的影响及其对分子信号通路的调节。 方法建立脊髓全横断损伤(SCT)模型,不同时间点进行BBB评分、体感诱发电位、运动诱发电位以及病理学检查验证模型可靠性。建模成功后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体LipofectamineTM 2000介导转染FB,应用免疫细胞化学和western blot鉴定BDNF在细胞内的表达,并验证BDNF的生物活性。将BDNF转基因FB用Hoechst33342标记后移植入损伤脊髓,评价BDNF转基因FB对动物行为学的影响;荧光显微镜观测FB或BDNF-FB在体内存活、分布情况;应用免疫组化技术检测损伤脊髓节段中BDNF的表达。用RT-PCR技术检测BDNF相关信号通路分子cyclin D1、Cyclin E、CDK、Bad、bcl-xl、CREB、p90rsk以及Stat3在脊髓与腓肠肌中的表达。 结果通过BBB评分、皮层体感诱发电位和运动诱发电位检测证明脊髓完全横断,证明SCT建模成功。RT-PCR确定BDNF基因产物为749bp的特异片段,构建于5.4kb的质粒pcDNA3经DNA测序验证,并成功构建于pcDNA3/BDNF重组质粒载体。将其转染FB后,免疫细胞化学、western blot结果表明BDNF在FB过表达;且具有促进PC12细胞生长的活性。BDNF转基因细胞移植入体内后,荧光显微镜下均见到移植细胞在损伤脊髓存活。BDNF-FB组大鼠BBB评分高于其它两组(P0.01)。说明BDNF转基因细胞移植促进SCT大鼠运动功能恢复。免疫组化学检测显示BDNF在脊髓大量表达。且脊髓cdk4和CyclinDl的基因表达在BDNF-FB组比对照组减少(P0.05);BDNF-FB组肌肉组织内CREB的表达也比其它两组减少(P0.05)。而BDNF-FB组肌肉组织内CyclinDl的表达则比其它两组增加(P0.05)。 结论BDNF基因修饰的FB移植后可在脊髓损伤处存活,表达BDNF蛋白,并促进神经功能的恢复。其分子机制与脊髓和肌肉CvclinD1、cdk4、CREB等分子信号通路调节有关。
【学位授予单位】:昆明医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R651.2

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【参考文献】
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