收藏本站
《昆明医学院》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

广谱中和活性样本HIV-1膜蛋白基因的克隆和功能鉴定

郝晓培  
【摘要】:[目的]从既往单采浆HIV-1慢性感染者中筛选有广谱中和活性的样本;克隆广谱中和活性样本的包膜蛋白基因并进行功能鉴定,分析获得的功能性env基因所制备的假病毒颗粒的中和特征,以构建适用于中和抗体评价用的假病毒颗粒;初步探讨广谱中和活性样本env基因的序列特征,分析特殊位点基因序列变异对毒株中和特性的影响,为进一步的广谱中和性单克隆抗体的分离、表位鉴定和疫苗免疫原设计提供参考信息。 [方法]本研究中应用代表A、B、C、B/C、A/E等不同亚型或流行重组型的25株假病毒通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术,从我国既往单采浆HIV-1慢性感染者中筛选有广潜中和活性的样本。从广谱中和活性样本血浆提取病毒RNA,进行逆转录PCR扩增获得cDNA,再用巢式PCR扩增获得env基因。将env基因扩增产物回收纯化后克隆到pcDNATM3.1 D/V5-His-TOPO载体,转化后挑取菌落进行菌落PCR和酶切鉴定,并制备假病毒进行功能筛选,对功能性假病毒进行中和敏感性测定。初步分析广谱中和活性样本env基因的序列特征,包括V3区序列、可变区和恒定区序列、糖基化位点以及特殊位点基因序列变异对中和特性的影响,进行同源性比较并构建系统进化树。 [结果]通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术筛选获得了3份具有广谱中和活性的样本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)。这三份样本在体外中和实验中均能中和所用25个毒株的80%以上,其中对B亚型的中和宽度最大,对8个测试毒株都表现了不同程度的中和活性,对AE亚型病毒株的中和能力最弱,对其他亚型毒株的中和活性介于B亚型和AE亚型病毒株之间。本研究结果显示极少部分筛查样本能够产生广谱中和抗体活性,导致这些感染者产生广谱中和抗体的机制目前仍不清楚。通过功能筛选从3个样本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)中各获得1个具有较高活性的质粒,构建的3个假病毒的半数组织感染量(TCID50)分别为781250、3906250、3906250 TCID50/ml。这:三个假病毒对自体血浆均表现一定的中和敏感性。三个假病毒均对4E10和和SCD4敏感。自感染者CBJC438制备的假病毒对IgGlbl2的中和敏感,中和50%病毒(IC50)的抗体浓度约为1.43μg/ml,另两个对此抗体的中和有抗性。自感染者CBJC524制备的假病毒对2G12的中和非常敏感,中和50%病毒(IC50)的抗体浓度约0.13μg/ml,另两个感染者制备的假病毒都对2G12的中和有抗性。自感染者CBJC438和CBJC521样本制符的假病毒对2F5的中和能力一般,IC50分别为13.05μg/ml、10.67μg/ml,感染者CBJC524制备的假病毒对2F5的中和有抗性。同源性比较及系统进化树分析结果表明这3份广谱中和样本扩增的HIV-1膜蛋白基因均属于B型。本研究结果也提示env基因的点突变和PNGSs的出现或位置改变可导致病毒的中和敏感性发生变化,与中和特征相关的突变散布于env基因中 [结论]应用假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体测定方法筛选获得了3份含广谱中和活性的HIV-1感染样品。从3份含广谱中和活性HIV-1感染样品构建并各筛选出一株功能较强的env基因,通过假病毒对血浆样品或单克隆抗体中和敏感性分析,表明这3个假病毒可以用于中和抗体的评价和env基因生物学特征的研究。对广谱中和活性样本中env基因序列初步分析结果显示个体内病毒env序列具有高度同源性,gp120 V3区氨基酸高度保守,研究结果也提示env基因的点突变或糖基化位点的改变可能与中和敏感性相关。构建系列突变体对研究中观察到的基因序列变化与中和敏感性间的关系进行系统分析将有助于确定引起中和敏感性发生改变的序列特征。广谱中和活性HIV-1感染样品的获得和功能性膜蛋白基因的克隆鉴定为进一步分离广谱中和性单克隆抗体,深入研究其识别表位,以设计更有效的疫苗免疫原提供了基础。
【学位授予单位】:昆明医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李关汉,康来仪,金子辰,潘启超,李燕婷,薛以乐;HIV-1 SH01株的生物学特征研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;1998年02期
2 宋晓岩;甲型肝炎灭活疫苗接种对HIV-1感染病程的影响[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1998年04期
3 刘国生;从75种传统药物中筛选抑制HIV-1蛋白酶活性的物质[J];国外医学.中医中药分册;1997年06期
4 阿沐;婴儿出生后的HIV-1母婴传播[J];中华医学信息导报;1997年18期
5 梁绍伶,刘伟,陈杰,梁富雄,李荣健;广西HIV-1流行毒株膜蛋白基因的扩增与纯化[J];广西预防医学;2000年03期
6 江文正,金宁一;表达HIV-1结构蛋白靶细胞的制备及鉴定[J];中国生物制品学杂志;2003年02期
7 沈成利,吴昊;急性HIV-1感染的传播和预防[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2004年02期
8 何海洋;乌干达拉凯地区一夫一妻制HIV-1传播的可能性[J];国外医学.社会医学分册;2005年01期
9 曹凤,季阳;HIV-1 感染的长期非进展者的特征[J];中国性病艾滋病防治;1997年03期
10 李春元;影响HIV-1感染细胞从宫颈与阴道散播的高危因素[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;1998年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡勤学;;(HIV-1粘膜感染中的侵入、传播和抑制)(英文)[A];2004年中国科学院新生病毒性疾病控制学术讨论会摘要集[C];2004年
2 唐蔚;王辉;张洁云;何清;;HIV-1高暴露持续血清阴性者非特异性T细胞免疫功能的研究[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年
3 曾沛斌;杨通汉;黄毅;姚福柱;董向东;王憬惺;;云南省献血者人群HIV-1基因亚型分布的初步研究[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集(摘要篇)[C];2010年
4 余小玲;马丽英;卲一鸣;姜世勃;刘叔文;;中国流行的HIV-1毒株的药物敏感性研究[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
5 张静;刘学真;苏生利;黄涛;傅继华;于修平;邢辉;;山东省HIV-1流行株多个基因区的亚型分析[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
6 赵红;李津如;江龙;;多胺类化合物抑制HIV-1 TAR RNA与Tat的结合[A];中国化学会第十届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2004年
7 黄广宇;毛青;邓国宏;兰林;王宇明;;HIV-1母婴传播准种多态性与免疫学表位/细胞嗜性的关系研究[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年
8 毛芹超;夏承来;姜世勃;刘叔文;;酸性凝胶电泳法检测NB-64作为HIV-1进入抑制剂的作用机制[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
9 杨柳萌;王睿睿;李蓉涛;孙汉董;郑永唐;;五味子提取物SEA-10的体外抗HIV-1活性[A];中华中医药学会防治艾滋病学术研讨会暨2006年年会论文集[C];2006年
10 刘忠;聂超;吴稚伟;;HIV-1阳性血清抗体交叉反应[A];Programme and Abstracts of the International Symposium on Medical and Pharmaceutical Biotechnology[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 胡凌凌;特殊性质假病毒可确保试验人员安全[N];科技日报;2004年
2 靖九江;乳头状瘤假病毒疫苗应用前景广阔[N];中国医药报;2003年
3 李天书;刘云涛;新生病毒敲响警钟[N];中国医药报;2004年
4 通讯员  段文利 记者  范又;SARS免疫学研究取得新进展[N];光明日报;2007年
5 段文利;SARS康复者体内存在高水平中和抗体[N];健康报;2007年
6 刘汉权;穿心莲有望成为抗艾滋病新药原料[N];中国中医药报;2005年
7 段文利;我国SARS免疫学研究获得重要进展[N];中国医药报;2007年
8 王晓娟;治疗性乙肝疫苗进入临床,疗效即将公布[N];新华每日电讯;2004年
9 襄尔;清除“四种病毒”[N];丽水日报;2006年
10 一凡;科学论争与认知局限[N];中国妇女报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 种辉辉;人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒检测体系的建立与应用[D];吉林大学;2008年
2 靳昌忠;HIV-1性传播的关键分子DC-SIGN特异性表达机制研究[D];浙江大学;2011年
3 刘智慧;寡肽(OGP、HIV-1 tat~[47-57])的合成、聚合及功能研究以及NRSF/REST在转录调控方面的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
4 韩晓旭;我国部分地区HIV耐药变异和结构基因特征的研究[D];中国医科大学;2006年
5 孙坚萍;我国HIV-1主要流行毒株感染者中和免疫和免疫逃逸分析[D];中国疾病预防控制中心;2008年
6 李清秀;表达HIV-1的重组痘苗病毒的构建及免疫策略对含有蒙脱石的DNA疫苗免疫作用的影响[D];吉林大学;2004年
7 李学仁;HIV-1交叉中和表位与HBV S抗原融合表达及免疫效果研究[D];中国疾病预防控制中心;2008年
8 李朝阳;RNA干扰下调cyclin T1蛋白的表达及其对靶细胞和HIV-1的影响[D];武汉大学;2005年
9 尹春煜;中国HIV-1主要结构基因的序列变异性以及耐药相关性突变分析[D];复旦大学;2005年
10 苏擘;华中地区I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)分子流行病学及耐药基因型的研究[D];武汉大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郝晓培;广谱中和活性样本HIV-1膜蛋白基因的克隆和功能鉴定[D];昆明医学院;2011年
2 瞿小旺;1.中国株CN54HIV-1Pol P66/P51在大肠杆菌中的表达与纯化  2.鼠IL-12和IL-23作为基因佐剂与HIV-1 DNA疫苗共免疫研究[D];华中农业大学;2004年
3 李平;HIV-1整合酶与抑制剂相互作用的分子模拟研究[D];北京工业大学;2010年
4 马红霞;HIV-1中和抗体快速安全的评价体系的研究[D];吉林大学;2006年
5 耿庆茂;河南某地HIV-1耐药毒株的流行状况及新型耐药相关突变位点研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
6 耿庆茂;河南某地HIV-1耐药毒株的流行状况及新型耐药相关突变位点研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
7 李丹;HIV-1蛋白酶与抑制剂的分子动力学模拟[D];中国科学技术大学;2011年
8 李少雄;对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药型HIV-1药理模型的建立[D];河北医科大学;2008年
9 杨东;HIV-1整合酶抗药性机理及可溶性表达研究[D];北京工业大学;2010年
10 褚福亮;应用HIV-1特异性表位多肽HLA-Ⅰ类分子四聚体分析HIV-1感染者体内特异性CTLs的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026