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《昆明医科大学》 2016年
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电针调控Notch信号通路修复大鼠脊髓损伤的实验研究

耿鑫  
【摘要】:[背景]脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统的一种严重创伤,遗留严重的伤残,迄今还没有有效的临床治疗方法。脊髓损伤会导致部分神经功能障碍,因此,如何预防脊髓损伤引起的神经细胞凋亡,或替代已死亡的脊髓细胞并抑制损伤局部疤痕形成,创造适合神经再生的微环境,是脊髓损伤治疗的关键和难点。督脉电针治疗SCI有较好的临床疗效已得到医学界广泛的认可。本研究旨在研究大鼠急性脊髓损伤后电针治疗对脊髓修复的影响。在本文章中,选用成年雄性SD大鼠建立脊髓损伤动物模型;分组为:A组为正常对照组、B组为假手术组、C组为脊髓损伤组、D组为假手术+电针组、E组为脊髓损伤+电针组;分别在模型建立后1d、3d、7d、14d、21d、28d、56d分别进行BBB行为学评分、HE染色、免疫组化,免疫荧光和ELISA来观察电针对脊髓损伤大鼠的修复作用,并通过Notch信号通路的相关的因子的qRT-PCR和Western blot检测,来探究修复过程中Notch信号通路发挥的作用;实验结果表明,电针治疗大鼠脊髓损伤可能是通过抑制Notch信号通路促进内源性神经干细胞的增殖和分化进而促进脊髓损伤的修复。第一部分SD大鼠钳夹型急性胸段脊髓损伤模型的建立与电针治疗[目的]钳夹型脊髓损伤模型现已广泛应用于研究实验大鼠的脊髓损伤;钳夹产生的力量同时作用于脊髓的背腹两侧,非常类似于人类脊髓损伤机制,是目前接近于人非常常见的脊髓损伤类型;电针结合了中医穴位刺激和物理电刺激的优点,已有研究表明,电针可以治疗脊髓损伤;本实验在急性大鼠脊髓损伤后的Id、3d、7d、14d、21d、28d和56d的7个时间点上,采用多种评估方法,其中包括每天观察大鼠的生存情况、体重变化、BBB评分、HE染色和病理组织形态学评估,评价脊髓损伤模型的构建水平以及电针治疗脊髓损伤的效果。[方法]1、本实验随机将210只SD大鼠分为5组:对照组、假手术组、模型组、假手术+电针组、模型+电针组,每组42只大鼠;模型组使用动脉瘤夹建立脊髓钳夹脊髓损伤模型;对照组不做任何处理;假手术组打开椎管暴露脊髓,但不造成脊髓损伤;模型+电针组先进行脊髓损伤模型建立,次日进行电针治疗;假手术+电针组先打开椎管暴露脊髓,不做任何损伤,次日进行电针治疗。2、观察每组大鼠的生存情况并绘制生存曲线,是评估脊髓损伤的直观方法;每天记录大鼠的死亡情况,以时间为横坐标,生存率为纵坐标绘制各组大鼠的生存曲线。3、称量各组大鼠的体重,也是非常直接反应大鼠损伤情况的评估方法;以时间为横坐标,大鼠体重为纵坐标绘制体重变化曲线图。4、BBB评分与脊髓损伤后的行为学有非常良好的相关性;建模后在1d、3d、7d、14d、21d、28d和56d分别进行BBB行为学评分,评估大鼠后肢神经功能的恢复情况;评分范围在0-21分之间,最高分为21分,即正常大鼠BBB评分为21分。5.建模后,1d、3d、7d、14d、21d、28d和56d分别取损伤段脊髓组织进行HE染色检测,观察脊髓白质、灰质损伤及出血、坏死、空洞的情况。6、运用SPSS 13.0和Graphpad prism 5.0软件进行分析,所有数据比较采用单因素方差分析进行检验,以α=0.05作为检验标准。[结果]1、生存曲线和体重变化结果显示,脊髓损伤模型组的大鼠死亡率明显高于模型+电针组,差异有统计学意义(P0.05),这说明电针处理可以修复脊髓损伤;在对照组,假手术组及假手术+电针组3个组之间的体重均无明显差异,模型组和模型+电针组在手术1d后开始减轻,但模型组较模型+电针组减轻的要多;到21天后体重不在下降并开始回升;脊髓损伤模型的大鼠的体重从1天到21天呈逐渐下降的趋势,21天后趋于稳定,在56天时候体重有所回升。2、BBB评分结果显示,对照组,假手术组和假手术+电针组,这三个组在不同时间的评分均为21分,模型组和模型+电针组在1d的评分都为0,说明模型建立成功,脊髓损伤造成大鼠后肢瘫痪。随着时间的增加,模型组和模型+电针组大鼠的BBB评分也逐渐增加,而模型+电针组在Id、3d、7d、14d、21d、28d、56d时间点的评分均较模型组显著提高,差异有统计学意义(P0.05),但明显低于正常组,假手术组及假手术+电针组。3、HE染色结果:脊髓损伤1d组可见中央管结构被破坏,白质出现水肿,可见少量出血灶;3d后可见病变中心区域灰质、白质水肿,结构破坏,白质灰质中可见大量出血灶,脊髓神经元结构破坏,损伤区域脊髓灰白质中可见空泡,神经元细胞肿胀,可见一部分神经元细胞核固缩,脊髓灰内质交界不清晰;7d后灰质、白质结构紊乱、分界不清,灰质板层消失,损伤区域脊髓灰白质中仍可见空泡;14d中仍可见灰白质界限不清,未见出血灶,损伤区域脊髓灰白质中可见空泡;21d后灰白质交界隐约可见,神经元水肿明显减轻,脊髓损伤处仍可见空泡;28d组灰白质病变逐渐恢复,可见灰白质界限出现,仍有少量空泡存在;56d后肿胀和小空泡隐约可见,可见清楚的灰白质界限;对照组,假手术组和假手术+电针组组织结构清晰;模型+电针组与模型组相比,损伤减轻。[结论]本实验使用医用脑动脉瘤夹建立了急性胸段脊髓损伤模型,通过穴位(大椎穴和命门穴)的电针治疗建立了电针治疗脊髓损伤的模型,并运用行为学(BBB评分)和病理学(HE染色)的检测方法去评估脊髓损伤模型的建立和电针修复脊髓损伤的治疗效果;评分结果提示模型+电针治疗组大鼠后肢运动功能的恢复情况比SCI组更快、更好,随着电针治疗时间的延长,差异更显著;模型组的大鼠后肢运动功能在一定程度上也能够恢复,但是模型+电针组恢复情况明显优于模型组,说明了电针能促使脊髓损伤的恢复:在病理切片上,脊髓石蜡切片的HE染色结果也同样显示了脊髓损伤模型构建是成功的,并且证明电针可以减轻和修复脊髓损伤;本实验分5组(正常组、假手术组、模型组、假手术+电针组、模型+电针组),每组一共设置了7个时间点(1d、3d、7d、14d、21d、28d、56d),这为细分脊髓损伤的修复和治疗阶段提供了有力的实验依据;本研究建立的SD大鼠钳夹型急性胸段脊髓损伤模型,反映了脊髓损伤的病理变化,具有可操作性、易重复、简单和稳定,为后续继续研究脊髓损伤的病理生理机制提供了坚实的基第二部分电针对大鼠脊髓损伤模型过程中炎症因子的影响[目的]脊髓损伤后会造成机体发生继发性的损伤,其中血-脊髓屏障的破坏就会引起大量的炎症因子浸润,从而阻碍了脊髓损伤的修复;本实验将研究电针修复脊髓损伤对炎症因子的影响,从而探讨电针修复脊髓损伤的机制。[方法]1、实验大鼠随机分为5组:对照组、假手术组、脊髓损伤组、假手术+电针组和脊髓损伤+电针组;在1d、3d、7d、14d、21d、28d、56d不同时间点,采用股静脉取血收集全血样本。2、离心收集血清,用ELISA方法检测血清样本中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-1α (IL-1α),白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的含量。3、运用SPSS13.0和Graphpad prism 5.0软件进行分析,所有数据比较采用单因素方差分析进行检验,以α=0.05作为检验标准。[结果]1、同一时间点不同组之间相比,对照组、假手术组和假手术+电针组的炎症因子表达均没有变化;脊髓损伤组的炎症因子表达明显高于其他组,而脊髓损伤+电针组炎症因子表达低于脊髓损伤组,但仍高于对照组。2、脊髓损伤组的不同时间点相比,在3天时,炎症因子表达最高,7天后开始逐渐下降;脊髓损伤+电针组也有同样的趋势变化。[结论]1、脊髓损伤造成炎症因子的大量表达。2、电针可以抑制脊髓损伤造成的炎症反应。第三部分电针对大鼠脊髓损伤模型过程中内源性神经干细胞的影响[目的]脊髓损伤后内源性神经干细胞会分化为胶质细胞,造成瘢痕而阻碍脊髓损伤的修复,而促进内源性神经干细胞的增殖可以促进脊髓损伤的修复;Nestin、GFAP、GALC分别是神经干细胞,星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物;本章节主要研究电针对Nestin、GFAP、GALC表达的影响,从而探讨电针对脊髓损伤修复过程中内源性神经干细胞的增殖与分化的影响。[方法]1、实验大鼠随机分为5组:对照组、假手术组、脊髓损伤组、假手术+电针组和脊髓损伤+电针组。在Id、3d、7d、14d、21d、28d、56d不同时间点,收集损伤段脊髓样本。2、采用实时荧光定量PCR的方法,检测样本中Nestin、GFAP、GALC在mRNA水平的变化。3、采用wertern blot的方法,检测样本中Nestin、GFAP、GALC在蛋白水平的变化。4、采用免疫组化和免疫荧光的方法,检测样本中Nestin、GFAP、GALC的表达变化。5、运用SPSS 13.0和Graphpad prism 5.0软件进行分析,所有数据比较采用单因素方差分析进行检验,以α=0.05作为检验标准。[结果]1、QPCR结果显示,同一时间点不同组之间相比,对照组、假手术组和假手术+电针组的Nestin、GFAP、GALC表达均没有变化;而在脊髓损伤组中GFAP和GACL表达随时间增加逐渐增加,到14天后开始降低,Nestin随时间增加逐渐降低,到14天趋于稳定;而在脊髓损伤+电针组中,Nestin、GFAP、GALC均与在脊髓损伤组中变化一致;但与脊髓损伤组相比,电针处理后降低了GFAP和GALC的表达,增加了Nestin的表达。2、western blot结果显示与QPCR结果一致。3、免疫组化结果显示,与对照组、假手术组和假手术+电针组相比,脊髓损伤组和脊髓损伤+电针组中的GFAP、GALC阳性细胞都明显增多,在14天达到最大值;而Nestin阳性细胞都明显减少,14天减少到最低状态;但与脊髓损伤组相比,电针治疗后,GFAP、GALC阳性细胞被明显抑制,而Nestin阳性细胞被增加。4、GFAP和Nestin的免疫荧光结果与免疫组化结果一致。[结论]1、脊髓损伤抑制内源性神经干细胞的增殖,促进内源性神经干细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。2、电针可以促进内源性神经干细胞增殖,并抑制内源性神经干细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,从而抑制胶质瘢痕的形成达到修复脊髓损伤的目的。第四部分电针对大鼠脊髓损伤模型过程中Notch信号通路的影响[目的]脊髓损伤的修复主要是内源性神经干细胞在起作用,而内源性神经干细胞的活动受到许多信号通路的调控;Notch信号通路是调控神经干细胞的主要通路之一,那么脊髓损伤后Notch信号通路是怎么变化的呢?电针又对Notch信号通路起着什么样的作用呢?这些问题都将在本章节中进行研究,本章主要从Notch信号通路相关蛋白(Notch1、Notch3、Notch4、ps1和Hes1)的表达变化来探讨电针对Notch信号通路的影响。[方法]1、实验大鼠随机分为5组:对照组、假手术组、脊髓损伤组、假手术+电针组和脊髓损伤+电针组;在Id、3d、7d、14d、21d、28d、56d不同时间点,收集损伤段脊髓样本。2、采用实时荧光定量PCR的方法,检测样本中Notch1、Notch3、Notch4、ps1和Hes1在mRNA水平的变化。3、采用wertern blot的方法,检测样本中Notch1、Notch3、Notch4、ps1和Hes1在蛋白水平的变化。4、运用SPSS13.0和Graphpad prism 5.0软件进行分析,所有数据比较采用单因素方差分析进行检验,以α=0.05作为检验标准。[结果l1、QPCR结果显示,同一时间点不同组之间相比,对照组、假手术组和假手术+电针组的Notch1、Notch3、Notch4、ps1和Hes1表达均没有变化;而在脊髓损伤组中Notch1、Notch3、Notch4、ps1和Hes1表达随时间增加逐渐增加,到14天表达最高,14天后开始下降;而在脊髓损伤+电针组中,Notch1、Notch3、Notch4、 ps1和Hes1均与在脊髓损伤组中变化一致;但与脊髓损伤组相比,电针处理后降低了Notch1、Notc1、Notch4、ps1和Hes1的表达。2、western blot结果显示与QPCR结果一致。[结论]1、脊髓损伤激活了Notch信号通路。2、电针可以抑制脊髓损伤激活的Notch信号通路相关蛋白。3、电针治疗大鼠脊髓损伤的机制可能是通过抑制Notch信号通路起作用的。
【学位授予单位】:昆明医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R651.2

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