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《昆明医科大学》 2018年
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骨髓间充质干细胞通过ERK1/2通路分化为肠上皮样细胞的研究

石梦琳  
【摘要】:[目的]旨在讨论肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells-6,IEC-6)在诱导骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)分化过程中的机制,为骨髓间充质干细胞的分化机制提供参考。[方法]1.用全骨髓贴壁培养法从大鼠股骨和胫骨中提取骨髓间充质干细胞并培养,从细胞形态、细胞表面抗原、细胞成脂诱导方面对其进行鉴定。2.实验分组为实验共培养组BMSCs+IEC-6和空白对照组BMSCs+BMSCs。将IEC-6和BMSCs分别置于Transwell上、下室中共同培养3、7、10天,诱导BMSCs的分化,后用免疫荧光技术检测CK、Villin的表达情况。3.实验分组为实验共培养组BMSCs+IEC-6、实验抑制组BMSCs+IEC-6+U0126 和空白对照组 BMSCs+BMSCs。用 Transwell 共同培养 36h和72h,用Western Blot的方法检测ERK1/2通路相关蛋白p-ERK1/2和p-MEK1/2的表达情况。[结果]1.用全骨髓贴壁培养法分离获取的BMSCs,呈长梭形生长,放射状排列;细胞表面抗原标志物CD29呈阳性,阳性率为99.77%,细胞表面抗原标志物CD34呈阳性,阴性率为9.71%;能被诱导分化为脂肪细胞,且油红O染色呈红色,符合BMSCs的鉴定标准。2.通过Transwell将BMSCs与IEC-6共培养3天、7天、10天,细胞经细胞免疫荧光技术检测后发现,细胞表达上皮细胞特性细胞角蛋白(CK蛋白)和绒毛蛋白(Villin蛋白)。随着共培养时间的延长,细胞形态发生明显变化。共培养3天时,有极少数细胞形态发生变化;共培养7天时,部分细胞变为类圆形;共培养10天时,大部分细胞由长梭形变为圆形。3.通过Western Blot技术检测ERK1/2通路相关蛋白后发现:单纯的干细胞组不表达p-MEK1/2和p-ERK1/2;未加入ERK1/2通路抑制剂U0126的实验共培养组高度表达p-MEK1/2和p-ERK1/2,且共培养72h的表达量高于共培养36h,差异有统计学意义(P0.05);加入U0126后抑制组36h p-MEK1/2和p-ERK1/2表达量明显低于实验共培养组,差异有统计学意义(P0.05);抑制组72h高度表达p-MEK1/2和p-ERK1/2,差异无统计学意义(P0.05)。加入ERK1/2通路抑制剂U0126(抑制组36h)后,MEK1/2的磷酸化被抑制,不能激活其下游的ERK1/2,导致下游的ERK1/2不能发生磷酸化以影响下一步细胞的分化。[结论]1.采用全骨髓贴壁培养法,能在体外条件下分离和培养大鼠BMSCs,且细胞活性好,能用于后续实验。2.在Transwell中用IEC-6诱导BMSCs的分化后,BMSCs可以被诱导分化为肠上皮样细胞,不但细胞形态发生明显变化,且能够表达肠上皮细胞的CK、Villin 蛋白。3.加入ERK1/2通路抑制剂U0126的抑制组(抑制组36h)p-MEK1/2和p-ERK1/2表达明显下降,MEK1/2的磷酸化被抑制,不能激活其下游的ERK1/2,导致下游的ERK1/2不能发生磷酸化以影响下一步细胞的分化。说明MAPK通路的分支通路ERK1/2通路在BMSCs向肠上皮样细胞的分化过程中发挥了重要作用。
【学位授予单位】:昆明医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R329.2

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