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VP3与改良型TAT-VP3基因的真核表达及诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

王春晖  
【摘要】: 目的探讨鸡贫血病毒VP3基因和改良型TAT-VP3基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达、诱导人膀胱癌BIU-87细胞株凋亡的效应。 方法构建重组真核表达载体PcDNA3-VP3和PcDNA3-TAT-VP3,并采用Lipofectamine ~(TM)2000介导的基因转染法分别转染人膀胱癌BIU-87细胞株,利用RT-PCR技术检测VP3基因和改良型TAT-VP3基因在BIU-87细胞中的表达状况。通过HE染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。运用JC-1荧光染色法和Annexin V-EGFP/PI双染法区分不同时相凋亡早、中晚期的BIU-87细胞。利用MTT法检测BIU-87细胞的增殖活性,并通过流式细胞仪使用TUNAL法检测转染重组质粒后BIU-87细胞凋亡的凋亡率。 结果成功构建了2个重组质粒,酶切鉴定及测序分析表明插入片段和预期相符;RT-PCR结果表明,转染后VP3基因和改良型TAT-VP3基因在细胞中得到了表达。光镜和透射电镜下均能观察到凋亡细胞的典型形态学特征。JC-1法能在早期观察到BIU-87细胞发出绿色荧光,Annexin V-EGFP双染法将不同时相凋亡早、中晚期的BIU-87细胞区分开来。MTT法检测结果显示转染2种重组质粒PcDNA3-VP3和PcDNA3-TAT-VP3的BIU-87细胞的增殖活性均明显下降(P<0.01);TUNAL法检测转染PcDNA3-VP3后24h、48h、72h的BIU-87细胞凋亡率分别为(26.3±1.96)%、(48.83±1.03)%、(68.50±3.00)%;转染PcDNA3-TAT-VP3后24h、48h、72h的BIU-87细胞凋亡率分别为(14.3±0.59)%、(30.50±0.77)%、(42.27±2.66)%,明显高于转染PcDNA3组及细胞、脂质体对照组(P<0.01)。 结论鸡贫血病毒VP3基因的表达能够早期、高效地诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡;重组质粒PcDNA3-TAT-VP3表达的TAT-VP3融合蛋白也能早期、高效地诱导人膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡,为今后进一步制备和纯化TAT-Apoptin融合蛋白及活性研究奠定了实验基础。


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