脂肪干细胞分离培养及修复软骨缺损的实验研究

【摘要】： 因创伤、炎症、退变等原因导致的软骨损伤和缺损在临床上十分常见。由于软骨细胞是终末分化细胞,而且软骨组织无直接的血液供应和神经支配,软骨损伤后自身修复能力非常有限。长期以来,人们试图采用各种方法修复受损软骨,但效果一直未能令人满意。软骨损伤修复仍然是目前临床和基础研究中继续探索的难题。 组织工程学的兴起和发展为软骨损伤修复带来了新的技术和方法。组织工程化软骨的构建涉及三个方面的内容:种子细胞、支架材料和组织构建。种子细胞是组织工程学的首要因素,种子细胞来源受限是目前阻碍软骨组织工程广泛应用于临床的关键性问题。自体软骨细胞是目前唯一批准用于临床的种子细胞,但自体软骨细胞来源有限、体外扩增困难、容易老化。寻找能够替代软骨细胞的种子细胞是近年来软骨组织工程研究的热点。骨髓间充质干细胞是近年来研究较多的用于替代自体软骨细胞的软骨组织工程种子细胞,由于骨髓总量有限,而且间充质干细胞在整个骨髓单核细胞总数中所占的比例低,并且随着年龄增长,其比例逐渐下降,可获取的干细胞数量少,尤其是老年患者,限制了骨髓间充质干细胞的广泛应用。脂肪干细胞是近年来发现的一种成体干细胞,具有与骨髓间充质干细胞类似的多分化潜能和生物学特性,因来源丰富、取材方便,细胞获取量大等优点,迅速成为组织工程学、再生医学和药物筛选等的研究热点。脂肪干细胞的分离、培养和鉴定是所有研究的前提和基础。本实验第一部分拟分离、培养脂肪干细胞,检测证实其多分化潜能,为进一步研究使用脂肪干细胞奠定基础。 支架材料是影响组织工程化软骨构建质量的另一关键因素。理想的支架材料应该具有良好的可降解性、生物相容性和三维结构,应该是对细胞外基质的仿生,具有细胞外基质的功能和作用。本实验拟取兔髂骨,制备“双相”骨基质明胶,与脂肪干细胞复合后成软骨诱导培养,自体移植修复软骨缺损,观察支架的组织相容性和构建体系的有效性。本研究分为三部分进行。 第一部分脂肪干细胞分离培养和鉴定的实验研究 自新西兰大白兔皮下脂肪分离培养脂肪干细胞,观察其体外增值能力等生物学特性,检测表面抗原CD44的表达情况,成脂、成骨和成软骨诱导分化,观察其多向分化潜能。实验结果表明,我们获得的细胞具有很强的体外增值能力,长期传代后增值能力无明显改变;细胞CD44表达阳性;诱导培养后能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨样细胞。表明我们分离的细胞为脂肪干细胞。 第二部分脂肪干细胞为种子细胞体外构建组织工程软骨的实验研究 取兔髂骨,去除一侧骨皮质,制备“双相”骨基质明胶。脂肪干细胞接种到松质骨面,培养后电镜扫描观察细胞复合和增值情况。将细胞支架复合物在特定的软骨诱导培养液中培养,定期取材电镜扫描,番红0染色和RT-PCR检测软骨组织特异性基质的表达。结果显示我们制备的骨基质明胶一侧致密,一侧疏松多孔,细胞接种后在支架内黏附、生长良好,细胞外基质分泌旺盛;诱导培养2周后,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,番红0染色阳性。实验结果表明,骨基质明胶可以作为脂肪干细胞的支架材料,我们构建的细胞支架复合物经诱导培养后形成了软骨样组织,可进一步用于体内实验,移植修复关节软骨缺损。 第三部分脂肪干细胞复合支架材料移植修复软骨缺损的实验研究 取第三代脂肪干细胞,与骨基质明胶复合后在软骨诱导培养液中诱导培养2周,自体移植修复膝关节股骨髁部软骨缺损,同时设非诱导移植组、支架对照组和空白对照组。分别于移植术后4W、12W、20W取材,进行大体观察和组织学检测。实验结果表明,诱导移植组和非诱导移植组均较好地修复了软骨缺损,与支架对照组和空白对照组比较具有显著差异,而诱导移植组和非诱导移植组的差异没有统计学意义。 本研究表明,兔皮下脂肪组织中含有丰富的多潜能干细胞,这些细胞可以用作软骨组织工程种子细胞;以脂肪干细胞为种子细胞、骨基质明胶为支架材料构建的组织工程软骨可作为软骨缺损的移植材料,移植前可不经诱导。

【关键词】：组织工程 脂肪干细胞 细胞培养 软骨细胞 骨基质明胶
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R684
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