软骨细胞、骨髓基质干细胞复合“双相”骨基质明胶修复兔关节软骨缺损的对比性研究

【摘要】： 目的对比性观察兔自体/同种异体骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC_s)经培养诱导成的软骨前体细胞以及软骨细胞(Chondrocyte)复合自体“双相”骨基质明胶(Bone Matrix Gelatin,BMG)构建组织工程软骨,修复兔实验性膝关节软骨缺损的效果,以探讨不同组织工程软骨修复实验性关节软骨缺损的效能及可行性,为进一步临床应用提供实验依据。 材料和方法1.抽取兔胫骨骨髓,采用贴壁贴壁筛选法并行改良,获得贴壁生长的MSC_s,体外传代扩增获得足够数量,行CD34、CD44免疫组化鉴定、形态学观察,绘制生长曲线;第3代细胞密集时加入转化生长因子-β_1(Transforminggrowth factor-betal,TGF-β_1)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、维生素C(Vitamin C),诱导MSC_s向软骨细胞方向分化,获得软骨前体细胞,行免疫组化和Mallory染色鉴定并观察诱导效果;2.取兔膝关节表面软骨,Ⅱ型胶原酶一次消化法消化后体外单层培养,获得原代软骨细胞,传代扩增,行形态学观察,绘制生长曲线;免疫组化和Mallory染色鉴定;3.取兔髂骨,按照Urist的方法略作改进行脱脂、脱钙、去蛋白等处理,得到“双相”BMG,灭菌后低温保存;4.取六只兔分三组,分别于四肢肌肉内植入自体BMG、异体BMG及同种异体MSC_s复合自体BMG。术后12周处死,标本行大体观察和组织学观察;5.将培养获得的第三代软骨细胞、MSC_s诱导成的软骨前体细胞接种于自体“双相”BMG上,构建细胞—载体复合物,体外培养三天,扫描电镜观察。6.62只实验兔随机分成七组,动物模型的制作采用兔膝关节股骨内髁软骨缺损模型。A组植入自体MSCs+自体BMG复合物,B组植入同种异体MSCs+自体BMG复合物,C组植入自体软骨细胞+自体BMG复合物,D组植入同种异体软骨细胞+自体BMG复合物,E组植入自体BMG,F组不植入任何材料作为阴性对照,G组为正常关节组。分别于术后第8周、第12周取材行大体观察、行HE染色及Ⅱ型胶原免疫组化组织学观察,大体评分采用O'driscoll评分标准,用Wakitani法进行组织学评分。 结果1.采用骨髓离心+贴壁筛选法能够获得纯度较好MSC_s,免疫组化CD44阳性,CD34阴性,传代增殖可获得大量MSC_s,体外诱导后向软骨细胞方向转化效果较好,分化为软骨前体细胞,免疫组化及甲苯胺蓝染色阳性;2.电镜观察“双相”BMG表面粗糙,多孔隙,松质骨面孔隙大小100～800um,细胞在其孔隙内贴壁良好生长,皮质骨面孔隙大小10～40um,细胞层状覆盖于其表面,可作为起支撑作用的软骨下骨。BMG植入体内“肌袋”,12周在体内完全降解,无新生组织形成。BMG植入后未见明显排斥反应。同种异体MSC_s复合自体BMG植入肌肉12周完全降解,未见软骨样或骨样组织形成。3.体内植入第8、12周,A组、B组、D组及C组重建关节软骨缺损,为透明软骨样修复,关节面及软骨下骨结构完整,新生组织与周围正常组织整合满意。E、F组未能修复缺损,缺损周边软骨磨损加剧。Wakitani评分显示A组、B组、D组及C组在2个时间点的各项评分结果组间没有统计学差异(P＞0.05),但均优于E、F组,差异有统计学意义(P＜0.01);Ⅱ型胶原mRNA原位杂交显示,A组、B组、D组及C组缺损区修复组织中细胞阳性染色率明显高于E、F组,且差异有统计学意义((P＜0.01)。A组、B组、D组及C组第12周评分结果均优于第8周。 结论“双相”BMG是的组织工程软骨良好载体材料,其结合自体/同种异体软骨细胞、MSCs诱导的软骨前体细胞构建的细胞-载体复合物可修复兔关节软骨和软骨下骨缺损,8周及12周时,四种复合物均能不同程度的有效修复关节软骨缺损;在大体外观、组织结构评分上,尽管统计学无明显的差异,自体MSC_s源性软骨前体细胞和自体软骨细胞-BMG复合物修复组织的质量优于同种异体MSC_s源性软骨前体细胞和同种异体软骨细胞-BMG复合物修复组织。在某些方面,以自体MSC_s源性软骨前体细胞-BMG复合物为好。远期修复效果是否存在差异有待进一步观察。单纯BMG移植不能修复关节软骨缺损,形成的修复组织与自然修复组织相似,为纤维组织。同种异体软骨细胞、MSC_s诱导分化而来的软骨前体细胞、“双相”BMG体内移植后未产生明显免疫排斥反应。

【关键词】：组织工程 骨髓间充质干细胞 骨基质明胶 关节软骨缺损 同种异体 自体
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R687.4
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