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《昆明医学院》 2008年
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特异性小干扰RNA对肿瘤细胞血管内皮生长因子表达的影响及抗大肠癌血管生成的实验研究

马岚青  
【摘要】: 目的:利用RNA干扰(RNAi)技术设计、构建小鼠VEGF特异的RNAi表达体系pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,研究该表达体系抗BALB/c小鼠结肠癌生长及转移的作用,以探索结肠癌基因治疗的新途径。 方法:1.针对VEGF mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA相关基因片段,构建特异的siRNA表达载体pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。2.CT-26细胞分为转染重组质粒V1组(V1组)、重组质粒V2组(V2组)、重组质粒V3组(V3组)Lipofectamine组(Lp组)、空白细胞组(c组)、Scrambled组(Nc组),脂质体法基因转染小鼠结肠癌CT-26细胞,半定量RT-PCR、Western blot法、流式细胞技术检测siRNA阻断VEGF mRNA转录和VEGF蛋白表达的效率,应用MTT比色分析法和流式细胞技术观察siRNA阻断VEGF基因表达对CT-26细胞增殖、细胞周期分布及细胞凋亡的影响;3.小鼠分为转染重组质粒V1组(V1组)、重组质粒V2组(V2组)、重组质粒V3组(V3组)、生理盐水组(V0组),用CT-26细胞建立结肠癌皮下动物模型,建模同期通过异位接种肿瘤的皮下给真核表达质粒V1、V2、V3及生理盐水,观察各组小鼠体重变化及肿瘤生长情况;接种CT-26细胞2周后处死全部小鼠,完整剥离肿瘤,称重、测体积,免疫组织化学法检测肿瘤VEGF表达及微血管密度,半定量RT-PCR、Western blot法检测肿瘤组织VEGF mRNA转录和VEGF蛋白表达。4.小鼠分为转染重组质粒V1组(V1组)、重组质粒V2组(V2组)、重组质粒V3组(V3组)、生理盐水组(V0组),从脾脏下极包膜内接种CT-26细胞,建立结肠癌肝脏转移动物模型,建模同期给予真核表达质粒V1、V2、V3腹腔注射,观察各组小鼠体重变化;接种CT-26第19天后处死全部小鼠,取出肝脏和脾脏,称重,病理学检查,体视学计数肝脏肿瘤转移灶,免疫组织化学法检测肝脏肿瘤VEGF表达及微血管密度。5.小鼠分为转染重组质粒V1组(V1组)、重组质粒V2组(V2组)、重组质粒V3组(V3组)、持续低级剂量希罗达组(X组)、生理盐水组(V0组),用CT-26细胞建立结肠癌皮下动物模型,建模同期通过异位接种肿瘤的皮下给真核表达质粒V1、V2、V3、生理盐水及小剂量希罗达灌胃,观察各组小鼠体重变化及肿瘤生长情况;接种CT-26细胞2周后处死全部小鼠,完整剥离肿瘤,称重、测体积,免疫组织化学法检测肿瘤VEGF表达及微血管密度,Western blot法检测肿瘤组织VEGF蛋白表达。 结果:1.成功构建针对小鼠VEGFmRNA序列siRNA表达载体:pSilencer4.1CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,并经酶切及测序鉴定完全正确。2.重组质粒脂质体法转染CT-26细胞,RT-PCR和Western Blot检测V1、V2、V3组肿瘤细胞VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较Lp组、c组、Nc组明显下降,其间差异有统计学意义(P<0.01),其中又以V1、V2基因沉默效率优于V3(P<0.05)。3.MTT分析结果显示V1、V2、V3组肿瘤细胞的生长较Lp组、c组、Nc组被明显抑制,其间差异有统计学意义(P<0.01),其中,又以V1、V2组肿瘤细胞生长被抑制为明显,与V3相比,差异有统计学意义(P<0.05);4.流式细胞技术检测:①细胞周期分布分析提示V1、V2组G0/G1期细胞比例较V3组、Lp组、c组、Nc组增高,S期和G2/M期细胞比例降低,其间差异有统计学意义(P<0.05)。②CT-26细胞VEGF荧光强度检测显示,V1、V2、V3组肿瘤细胞VEGF荧光强度较Lp组、c组、Nc组明显减弱,其间差异有统计学意义(P<0.01),其中又以V1、V2组VEGF荧光强度减弱为著,较V3组差异有统计学意义(P<0.05);③V1、V2、V3组肿瘤细胞凋亡与Lp组、c组、Nc组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。5.注射重组质粒V1、V2、V3荷瘤小鼠肿瘤体积和重量明显小于V0组(P<0.05),肿瘤组织中VEGF表达和微血管密度明显低于V0组;RT-PCR和Western Blot检测V1、V2、V3组肿瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较V0组明显下降(P<0.01),其中V1、V2组肿瘤组织VEGF表达、微血管密度、VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较V3弱(P<0.05)。6.在对肝转移动物模型中发现,V1、V2、V3组小鼠肝脏肿瘤体积和重量明显小于V0组(P<0.05);离体肝脏肿瘤计数V1、V2、V3组较V0组少(P<0.01),而V1、V2组又比V3组减少(P<0.05)。7.在与持续小剂量希罗达(X组)抗肿瘤对照实验中发现,V1、V2、V3组与X组肿瘤体积和重量明显小于V0组(P<0.05);肿瘤组织中VEGF表达和微血管密度V1、V2、V3组与X组明显低于V0组(P<0.01),而其中V1、V2组、X组又低于V3组(P<0.05);Westem blot检测肿瘤组织VEGF蛋白表达V1、V2、V3组、X组较V0组明显下降(P<0.01),而V1、V2组、X组又比V3组VEGF蛋白表达弱,其间差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:1.应用表达载体法成功构建VEGF基因特异的siRNA干扰表达体系pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA。2.pSilencer4.1 CMVneo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA经脂质体法转染靶细胞后能显著地发挥基因沉默效应,其中以针对靶基因编码区的siRNA基因沉默效应更为显著。3.注射pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA能使小鼠荷瘤模型中肿瘤生长、肿瘤转移、肿瘤组织血管生成及VEGF表达明显受到抑制,其中以针对靶基因编码区的siRNA效果更为为显著。4.针对靶基因编码区的siRNA沉默VEGF抑制肿瘤组织血管生成及VEGF表达效果与持续小剂量希罗达给药效果相当。5.针对VEGF的RNA干扰技术是一项具有临床应用前景的新型结肠癌基因治疗手段。
【学位授予单位】:昆明医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R735.3

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【参考文献】
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