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《昆明医学院》 2010年
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缺血后处理抗大鼠肾缺血—再灌注损伤的作用机制研究

云宇  
【摘要】: [研究背景和目的] 肾脏是高灌流、对缺血-再灌注易受损伤的器官。缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)在许多肾脏疾病,例如:肾移植、肾部分切除术、肾动脉血管成形术、动脉分流术、意外创伤、肾积水和输尿管手术过程中均会发生,是临床上导致急性肾功能衰竭的主要原因之一,死亡率较高,且存活的患者也会发生不同程度的慢性肾功能损害。因此,寻找防治肾脏缺血-再灌注损伤的方法与措施一直是近年来研究的热点的问题。 缺血预处理(ischemic preconditioning,IPreC)是目前公认的一种有效的抗器官组织缺血-再灌注损伤的机械性干预措施。1999年,Toosy等证实给予肾脏几个短暂的停灌/再灌处理,可以对后来发生的长时间的缺血损伤有比较明显的保护作用。但是,缺血预处理必须在IRI发生之前进行,这对于许多无法预期的肾脏缺血性疾病是不可能实现的,例如:在肾移植中,肾源的供给许多是无法预料的,也不可能有进行缺血预处理的时机,使缺血预处理的临床应用受到很大的限制。 缺血后处理(ischemic postconditioning,IPostC)是2003年由Vinten-Johansen's研究小组提出了一种新的机械性干预措施,即在心肌缺血发生之后,再灌注开始时给予3个短暂循环的再灌/停灌的处理。这种新的干预措施可以缩小心梗面积、保护内皮功能、减轻细胞水肿、减少缺血梗死区中性粒细胞的聚集和改善心功能,对心肌缺血-再灌注损伤有比较明显的保护作用,且作用程度与缺血预处理相似。与缺血预处理不同,缺血后处理是在组织器官缺血之后才实施,在临床上应用具有“简单、可行、有效”三大特点,目前被认为是一种防治缺血性疾病的新的机械性抗损伤措施,广泛地被应用于抗器官组织缺血-再灌注损伤的防治。 因此,本研究探讨了缺血后处理对肾脏IRI的保护作用,通过与缺血预处理相比较,从整体、细胞和分子水平上阐明缺血后处理抗大鼠肾脏IRI的作用机制,本研究可为外科抗肾脏缺血-再灌注损伤提供新的策略,也可为缺血后处理防治肾脏缺血-再灌注损伤的应用提供理论和实验依据。 [方法] SPF级SD雄性大鼠,体重:180~220 g,随机分为①假手术组(Sham组):仅行开腹右肾切除,左肾蒂分离,不夹闭;②缺血-再灌注组(I/R组):开腹右肾切除,左肾蒂分离,无创血管夹夹闭45 min;③缺血预处理组(IPreC组):开腹右肾切除,左肾蒂分离,行3个循环夹闭2 min/再灌5 min预处理后,无创血管夹夹闭45 min;④缺血后处理组(IPostC组):开腹右肾切除,左肾蒂分离,无创血管夹夹闭45 min后,行6个循环夹闭10 sec/再灌10 sec后处理,各组再灌24 h。 本研究分两个部分: 1.缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用 应用分光分析法测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)评价肾功能;HE染色观察肾组织病理形态学改变,评价缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用。 2.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的机制研究 分别从以下3方面进行探讨: A从抗氧化途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用机制 应用分光分析法测定肾组织丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性:采用Real Time RT-PCR和Western blotting法分别测定SOD mRNA和蛋白表达情况,探讨缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用机制。 B从抗炎途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用的机制 应用分光分析法测定肾组织中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)活性,采用Real Time RT-PCR和Western blotting法分别测定环氧酶(COX-1,COX-2)mRNA和蛋白表达情况,探讨缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用的机制。 C从抗细胞凋亡途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用机制 应用DNA琼脂糖凝胶电泳法和末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测大鼠肾组织细胞凋亡发生情况;采用Real TimeRT-PCR和Western blotting法分别测定Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表达情况,探讨缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用的机制。 [结果] 1.缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用 ①肾功能的评价 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的Cr及BUN水平明显升高(P<0.05);与I/R组比较,IPreC和IPostC组的Cr及BUN水平明显降低(P<0.05),IPreC和IPostC组Cr及BUN水平无明显差异(P>0.05)。 ②肾组织病理学观察 Sham组肾小球、肾小管没有发现明显的形态学改变,I/R组肾小管上皮细胞肿胀,出现水样变性和空泡变性,肾小管扩张,内可见管型和坏死脱落细胞,少量管腔内有蛋白性液体积聚,部分肾小管结构毁损,间质充血水肿,大量炎性细胞浸润,管周血管明显扩张淤血;IPreC和IPostC组肾小球轻度淤血,少量肾小管上皮细胞轻度水肿,空泡变性,少见管型,间质充血水肿,有少量炎性细胞浸润,管周稍有淤血。 2.从抗氧化途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用机制 ①各氧化指标的变化 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的MDA浓度明显升高,GSH浓度、SOD、CAT和GSH-Px活性明显降低(P<0.05);与I/R组比较,IPreC和IPostC组的MDA浓度明显降低,GSH水平SOD、CAT和GSH-Px活性明显升高(P<0.05),IPreC和IPostC组各个指标水平无明显差异(P>0.05)。 ②SOD mRNA和蛋白表达 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的SOD mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05),与I/R组比较,IPreC和IPostC组的SOD mRNA和蛋白表达相对升高,IPreC和IPostC相比,SOD mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。 3.从抗炎途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用的机制 ①MPO活性的变化 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的MPO活性明显升高(P<0.05);与I/R组比较,IPreC和IPostC组的MPO活性明显降低(P<0.05)。 ②COX蛋白表达 各组COX-1 mRNA和蛋白表达无统计学差异。与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的COX-2 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),与I/R组比较,IPreC和IPostC组COX-2的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05),IPreC和IPostC相比,COX-2的mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。 4.从抗细胞凋亡途径研究缺血后处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用的机制 ①肾小管上皮细胞凋亡的状况 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC细胞凋亡数明显增加,凋亡指数(AI)明显增高(P<0.05);与I/R组相比较,IPreC和IPostC细胞凋亡数明显减少,AI明显降低(P<0.05),IPreC和IPostC组AI无明显差异(P>0.05)。 ②Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达 与Sham组比较,I/R、IPreC和IPostC组的Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显下降,Bax mRNA和蛋白表达相对升高,Bcl-2/Bax下降(P<0.05);与I/R组比较,IPreC和IPostC组的Bcl-2 mRNA和蛋白表达相对升高,Bax mRNA和蛋白表达相对降低,Bcl-2/Bax明显升高(P<0.05),IPreC和IPostC相比,Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。 [结论] 1.肾缺血-再灌注使大鼠肾功能和结构受损,表现为Cr和BUN升高,肾小球、肾小管受损,MDA、MPO升高,GSH、SOD、CAT和GSH-Px活性降低,SOD的mRNA和蛋白表达下降,COX-2 mRNA和蛋白表达升高,肾组织细胞凋亡增加,Bcl-2 mRNA和蛋白表达降低,Bax mRNA和蛋白表达升高。 2.缺血后处理能减轻Cr和BUN水平,减轻肾组织结构的损伤,具有显著的抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的作用。 3.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用机制与抗氧化有关,可能是通过清除氧自由基,抑制脂质过氧化,升高组织抗氧化物酶的活性和蛋白表达,提高肾组织的抗氧化能力。 4.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用机制与抗炎有关,可能是通过抑制中性粒细胞聚集,抑制COX-2 mRNA和蛋白的表达,从而抑制炎症介质的产生。 5.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用机制与抗细胞凋亡作用有关,可能是通过调控细胞凋亡相关基因Bcl-2/Bax mRNA和蛋白表达。 6.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用及其机制与缺血预处理有相似之处。 7.缺血后处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的作用及机制的研究有助于为防治肾脏缺血-再灌注损伤提供理论和实验依据,为外科抗肾脏缺血-再灌注损伤提供新的策略。
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