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云南省狂犬病流行特征及病毒分子流行病学研究

丁继超  
【摘要】:目的 狂犬病病毒(Rabies virus)属弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病病毒属(Lyssavirus),是有包膜的单股负链RNA病毒。该病毒具有较强的神经组织嗜性,是致死性传染病—狂犬病的病原体。狂犬病病死率几乎为100%,目前尚无有效治疗药物。云南省地域辽阔,自然条件较为复杂,垂直气候十分明显,许多地区属于热带、亚热带气候,也有高寒山区的广泛存在,适于各类宿主动物的繁殖和狂犬病病毒的存在及传播,是国内狂犬病发病率较高的省份之一。本研究对1976—2009年云南省狂犬病流行病学资料进行整理、统计和分析,以期阐明云南省狂犬病的流行病学特征和流行趋势等,并应用分子生物学技术对2008年和2009年云南的狂犬病病人及犬脑标本进行狂犬病病毒抗原检测、基因分型及序列测定和分析,以掌握云南狂犬病病毒的基因型分布和分子遗传特征,为进一步搞好狂犬病防治提供科学依据。 方法 收集云南省1976~2009年狂犬病疫情及流行病学调查资料,用Excel建立数据库,用SPSS13.0统计软件进行统计分析,运用描述流行病学方法分析全省狂犬病的疫情信息。从高发的地区、时间和人群分布进行分析,并进行发病率、死亡率和病死率的统计分析。应用分子生物学技术对云南省近2年来的狂犬病病毒流行株进行分子特征研究,通过病毒抗原检测,阳性标本经提取核酸,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行扩增,测序公司返回的测序结果用ATGC软件拼接后,ClustalX软件进行完全比对;BioEdit软件进行序列的分析和剪切后再次用ClustalX软件对N和M基因核苷酸序列进行完全比对,用Mega3软件打开比对结果,选择Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发生树,因为该建树方法适合分析种(生物分类中的级别)水平以下的基因关系,Bootstrap值选择1000。DNAStar(5.01)软件中MegAlign对分析并剪切后的序列分别进行核苷酸和氨基酸序列间同源性比较,生成相应的数据表;GeneDoc软件制成核苷酸及氨基酸差异显示图。 结果 1976~2009年全省狂犬病发病死亡1497人,全省发病率波动范围在0.00~0.69/10万之间,年均发病率为0.115/10万,最高为0.69/10万(1989年)。20世纪70年代发病数较少,80年代流行最为严重,90年代逐渐下降,2006年以来发病数明显上升。13个州、市72个县(市、区)发生过病例,主要流行地区为昭通、曲靖、文山、红河州(市),其次为玉溪、楚雄和昆明市(州),近几年滇西德宏州和保山市也发生流行。全年均有病例发生,主要流行季节为5~10月。所有年龄组均有发病,最小年龄不到1岁,最大年龄为85岁。其中5岁以下年龄占全部发病人数的4.16%,5~9岁年龄组占16.89%,10~14岁年龄组占14.97%,15~19岁年龄组占8.83%,20~49岁年龄组占33.21%,50岁以上占2.15%,主要发病年龄在20~40岁之间。男性发病占73%,女性发病占27%,男女发病性别比为1:0.38。绝大多数患者为农民,占发病人数的64%,其次为学生(其中小学生占学生发病总数的75%)、儿童和工人等。 2008年~2009年在云南省文山、红河、德宏、西双版纳、曲靖、昭通、保山市(州)共采集标本616份,其中犬脑607份,唾液8份,脑脊液1份。免疫荧光法筛查犬脑607份,阳性为10份;试剂盒提取唾液、脑脊液9份,阳性6份。对16株云南狂犬病病毒N和M基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序(10份犬脑、5份唾液和1份脑脊液)。结果显示16株均含有完整的N和M基因序列。同源性分析表明,16株云南标本N和M基因核苷酸序列同源性范围分别为88.4%~100%和88.5%~100%,推导氨基酸序列的同源性分别为95.8%~99.8%和82.5%~99.5%。与狂犬病病毒基因3型(Mlkola)进行了比较,N基因核苷酸同源性和推导的氨基酸的同源性分别为65.8%和77.3%,M基因氨基酸和推导氨基酸序列同源性分别在71.4%~71.8%和77.8%~79.8%之间,同源性较低。结果显示,各毒株推导的氨基酸序列的同源性高于核苷酸序列的同源性。 结论 狂犬病在云南省广泛分布,全省16个州、市中有13个州、市72个县(市、区)发生过狂犬病流行,但各地发病率有明显差异,主要流行地区为滇东和滇南地区,病例主要集中在文山、红河、曲靖、昭通和西双版纳州(市)。云南省全年均有狂犬病流行,主要流行季节为5~10月。所有年龄组均有发病,主要发病年龄20-49岁,随着年龄组的增大发病数逐渐减少。病例男性多于女性,大多患者为农民。 云南省2008年和2009年16株狂犬病病毒流行株的N和M基因同源性和系统进化树分析表明,均属于基因Ⅰ型狂犬病病毒;核苷酸和氨基酸序列分析显示云南狂犬病病毒呈现地域特征;云南狂犬病病毒基本按来源地区的不同显示出较高的亲缘特性;种系发生树分析提示,云南狂犬病病毒与周边省份和邻近国家狂犬病流行有关,狂犬病病毒株除来自其他省份疫源地的病毒株外,极可能还有来自东南亚的病毒株;云南省存在狂犬病有进一步流行和扩散的可能。研究结果为进一步做好云南省狂犬病防治工作提供了科学依据。


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