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《西北大学》 2011年
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重组Arresten的外源表达及多甲氧基黄酮对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞胰岛素分泌的影响研究

陈洪栋  
【摘要】:恶性肿瘤和糖尿病都是严重危害人类健康的常见疾病,但目前仍然缺少有效的治疗和预防手段。因此开发新的高效治疗药物与手段,建立有效的预防措施一直是各国学者共同努力的方向。 Arresten是人Ⅳ型胶原α1链羧基末端非胶原蛋白结构域断裂产生的多肽片段,能特异性诱导血管内皮细胞凋亡,抑制其增殖、迁移和管腔形成,可有效抑制肿瘤的生长和转移,是一个具有潜在临床应用价值的强效血管生成抑制因子,有望成为具有良好应用前景的抗肿瘤血管生成药物。目前有多个研究机构正在寻求适合重组Arresten生产的外源蛋白表达方法以满足未来治疗用药需求。本研究通过引物设计、PCR扩增和限制性核酸内切酶作用,将实验室保存的克隆化Arresten编码基因分别亚克隆至原核表达载体和哺乳动物表达载体,为建立合适的Arresten外源生产表达系统、进一步开展Arresten结构与功能关系研究奠定研究基础。另外,实验过程中还通过动物细胞培养、MTT法、ELISA、放射性免疫测定等方法考察了多甲氧基黄酮对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞分泌胰岛素的影响作用,旨在为阐明多甲氧基黄酮抗糖尿病的作用机理、寻求天然抗糖尿病膳食补充剂、拓宽国内资源丰富的柑橘属植物的利用效率提供理论和技术依据。 已经取得以下研究结果: 1、成功构建了重组Arresten原核表达载体。通过引物设计、PCR扩增和限制性核酸内切酶作用,将实验室保存的克隆化Arresten编码基因定位克隆到原核表达载体pET22b (+) HindⅢ/BamH I位点之间,经核酸限制性内切酶消化和序列测定,获得重组Arresten原核表达载体。 2、采用CaCl2转化法实现重组Arresten原核表达载体对大肠杆菌细胞BL21(DE3)的转化,经SDS-PAGE电泳检测和Western bloting杂交检测,获得高效表达重组Arresten的E.coli B121 (DE3)稳定转化细胞,并通过镍柱亲和层析获得纯化的重组Arresten。 3、成功构建了重组Arresten哺乳动物细胞表达载体。通过引物设计、PCR扩增和限制性核酸内切酶作用,将实验室保存的克隆化Arresten编码基因定位克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-N1质粒绿色荧光蛋白编码框上游的HindⅢ/BamH I位点之间,经核酸限制性内切酶消化和序列测定,构建出与绿色荧光蛋白融合表达的重组Arresten哺乳动物细胞表达载体。 4、采用脂质体转染法,实现重组Arresten在哺乳动物细胞HEK293A细胞中的瞬时表达,建立了重组Arresten哺乳动物细胞HEK293A瞬时表达体系。 5、通过多甲氧基黄酮刺激大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞,经MTT法检测,多甲氧基黄酮在10gg/mL-80μg/mL作用浓度范围内,与对照组相比,对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞增殖的影响无显著统计学差异。 6、采用ELISA、放射性免疫测定和RT-PCR分析,初步揭示出多甲氧基黄酮作用不能直接刺激大鼠胰岛p细胞系INS-1细胞胰岛素分泌,药物作用24小时,对胰岛素表达无明显影响作用。
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R587.1;R73-3

【参考文献】
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