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《西北大学》 2011年
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葡萄籽糖蛋白的提取纯化及免疫活性研究

王芍  
【摘要】:葡萄籽来源于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis L.)葡萄(Vitis Vinifera Linn.)的干燥成熟种子,是葡萄酒生产过程中产生的副产品,随着人们生活品质的提高以及我国葡萄酒业的迅猛发展,每年葡萄籽的产量也大幅上升。有大量的研究集中于葡萄籽中的小分子化合物的抗癌、降血脂、抗氧化等药理功效,但在提取小分子物质的时候舍弃了大量的大分子物质。随着研究的深入,对大分子的物质也有所关注,美国肯塔基大学的一项研究表明葡萄籽水提取物蛋白,可激活癌细胞中负责调节细胞生命周期的物质,从而能引起癌细胞的凋亡。但关于葡萄籽中糖蛋白的研究尚未见报道。 本实验选用我国特有的酿酒葡萄龙眼品种的干燥籽为原料,采用相对温和的低功率超声辅助提取方法从葡萄籽中提取糖蛋白,并分离纯化出一种免疫活性糖蛋白。具体研究内容如下: 优化葡萄籽糖蛋白粗品的提取工艺,利用单因素分析法和正交实验优化葡萄籽糖蛋白的提取工艺,确定了葡萄籽糖蛋白的提取工艺路线为:取葡萄籽,除杂,粉碎过60目筛,石油醚回流脱脂至无色,加入12倍PBS(0.05mol/L; pH=7.2)---NaCl(0.1mol/L)缓冲液,在比较温和的较低的80 W功率下,超声时间30 min,50℃下提取240 min,重复操作3次,4℃以3000 r/min的速度离心15 min,倾出上清液弃去残渣,上清液浓缩,然后加乙醇使终浓度达到70%,来沉淀糖蛋白,4℃静置12 h, 6000 r/min离心15 min,上清液回收,沉淀用PBS缓冲液溶解,选用氯仿:正丁醇=5:1的Sevage试剂,与样品溶液的比例为1:3混合,振荡15min,重复操作3次,上层溶液透析48h,冷冻干燥,即得粗品糖蛋白。 葡萄籽糖蛋白粗品的活性分析,提取出葡萄籽糖蛋白粗品后,根据糖蛋白的功能及实验材料的来源(葡萄)的功效,选择免疫功能作为活性考察对象,采用脾细胞增殖作为活性指标,用MTT法检测葡萄籽糖蛋白对脾细胞增殖活性的影响,结果表明葡萄籽粗品糖蛋白在300μg/ml的浓度下显示具有显著促进脾细胞增殖的活性,说明葡萄籽糖蛋白有增强免疫的功能活性。 葡萄籽免疫活性糖蛋白成分的纯化定位。为了得到纯化的免疫活性糖蛋白单体,采用DEAE.52纤维素阴离子交换色谱法,Sephadex G-100、Sephadex G-75的凝胶柱色谱层析法对葡萄籽糖蛋白粗品进行分离,得到一种相对比较纯的物质,用脾细胞增殖试验进行检验,发现在100μg/ml浓度下即可产生显著的脾细胞增殖活性,浓度达到300μg/ml时,表现了极显著的脾细胞增殖活性,证明是一种能够增强免疫的活性物质。 免疫活性物质的结构定性分析。通过凝胶柱色谱、糖蛋白的考马斯亮蓝R-250染色和PAS染色双重染色、红外光谱扫描、硫酸-苯酚法及Bradford法测定糖和蛋白含量,气相色谱分析法等实验方法,验证得到的免疫活性物质是一种糖蛋白,蛋白含量为85.67%,多糖含量为9.26%;单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖,比例为1:7.6:4.2:1.5。
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R284.2

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【引证文献】
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