Brwd3对斑马鱼神经系统发育影响的转录组学分析

【摘要】：神经系统参与动物意识与行为的调控,对个体的心理、生理和行为能力都起着十分重要的作用。神经系统的发育一旦出现障碍往往会引发多种神经类疾病。通过对这类疾病的研究,可以为神经系统发育机制的探究提供线索与指示。既往研究发现BRWD3(bromodomain and WD repeat domain containing 3)基因与神经精神类疾病(如:智力发育障碍(intellectual developmental disorder,IDD)的发生显著相关,但是BRWD3基因是否影响个体神经系统发育,以及其具体的发生机制尚不明确。BRWD3作为转录调控因子,该蛋白质由WD40重复结构域(WD40 repeat,WDR)和bromodomain(Brd)结构域组成,它广泛分布于人体各个器官,而且在脑部具有较高表达。BRWD3蛋白通过介导蛋白质之间相互作用,一方面可转录调节多个目标基因,另一方面还可通过乙酰化用用参与染色质修饰。通过前期的研究和文献追踪,并结合疾病的致病特征,我们推测BRWD3基因可能是通过转录调控下游神经发育相关基因,从而影响机体的神经系统发育发生。本研究旨在探究BRWD3究竟是参与哪些基因的表达调控从而影响神经系统发育,并为基因与疾病之间存在的作用机制提供线索。本研究利用Morpholino的方法,对斑马鱼的brwd3基因进行诱变,然后选择斑马鱼胚胎发育的10-体节期(segmentation 10 somites,10s)时期胚胎做为神经系统发育研究材料,利用转录组测序方法检测并筛选实验组和对照组中受brwd3影响的表达差异基因,并在此基础上,构建出brwd3作用于斑马鱼神经系统发育的调控网络。在传统的转录组分析基础上,本研究对基因组选择、差异表达阈值调整和差异基因筛选等环节进行了调整,并结合现有数据库及数据挖掘手段,推测受brwd3转录调控目标基因,并通过网络构建研究brwd3在斑马鱼神经系统发育过程中的调控作用和调控网络。研究结果:1)通过RNA-Seq分析共得到基因25118个,其中阳性表达基因16879个。其中在斑马鱼胚胎时期脑中表达基因7574个,利用|log2FC|≥1和FDR≤0.05的差异表达基因(DEGs)的原则,筛选出差异表达基因474个,上调基因182个,下调基因292个。2)对上述DEGs进行GO功能富集分析,找出与神经系统发育相关的3个生物学功能条目:“sensory organ development(P=3.27E-03)”、“nervous system development(P=2.65E-06)”、“neuron differentiation(P=2.16E-03)”及其中包含DEGs 65个;随后对结合这些基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达分析及KEGG通路富集分析,推测有23个基因可能是受brwd3基因调控的下游基因,而且这些基因与“Wnt signaling pathway,Wnt”信号通路密切相关,此分析结果为后续构建brwd3基因调控网络提供重要依据。3)结合String等数据库信息,我们构建出了brwd3基因影响斑马鱼神经系统发育的基因调控网络。在这个调控网络中,brwd3反向调控fzd8a表达升高从而激活Wnt信号通路后调节下游靶基因,从而影响神经系统发育的调控机制。且我们构建的这个brwd3作用网络也在qPCR随机检测和网络关键结点基因的检测中得到印证(R=0.89,P=3e-06)。随后,我们所构建的BRWD3作用网络在2个细胞系中同样也得到的验证。当利用RNAi干涉技术影响2个细胞系(SH-SY5Y、MCF-7)的BRWD3基因表达后,网络中的4个关键节点基因的表达水平随之发生相应变化,而且这些基因的表达水平变化与本研究所构建的brwd3调控网络相吻合。本研究利用斑马鱼模型探索了brwd3基因影响神经系统发育的分子机制,同时构建出了该基因作用于神经系统发育的作用网络,为BRWD3基因表达变化从而影响神经系统发育的分子机制提供了线索,但是该brwd3-fazd8a-Wnt作用网络中,基因间的相互作用机制还需后续进行深度的研究与挖掘。