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高灵敏酪氨酸酶和碱性磷酸酶活性分析方法的构建及应用

杨利红  
【摘要】:酪氨酸酶(TYR)作为含铜氧化酶,可催化酪胺或酪氨酸氧化为多巴胺(DA),并进一步氧化为多巴醌,从而引发黑色素的形成。黑色素在黑色素瘤的发展中起关键作用,且与多种疾病的诊断有重要关系。此外,DA作为重要的儿茶酚胺神经递质,在人体的多种组织中起重要作用。同时碱性磷酸酶(ALP)在很多病例中也发挥重要作用,其酶含量的异常水平可引起或预示很多疾病。因此,开发一种简单、迅速且灵敏的DA、TYR和ALP的新探测方法是非常重要的。本文采用荧光检测的方法,首先基于TYR对酚胺类物质的特异性反应,引入氧化剂来加速反应构建了一种简便且灵敏的DA和TYR检测方法。其次,构建了基于香豆素衍生物的TYR检测荧光探针和可发生ALP和TYR酶级联反应的新型近红外荧光探针。主要研究内容如下:(1)利用过氧化苯甲酰促进间苯二酚和DA之间的原位荧光反应,建立了简单、经济、高效、高选择性和高灵敏的DA浓度和TYR活性测定方法。将过氧化苯甲酰引入系统可促进DA氧化,从而实现与间苯二酚的更快反应以形成荧光物质。该测定法能够测量未标记的荧光读数,并且产物的荧光强度信号取决于DA的浓度和TYR的活性。在测定DA时,其浓度在4.0 n M至1.2μM范围内具有良好的线性关系,R~2=0.9951,检出限低至0.8 n M,已成功应用于人尿样中DA的测定。此外,基于酪胺酶氧化为DA的方法,进一步建立了测定TYR活性的荧光方法,检测限为0.0013 U m L~(-1),用于测定小牛血清中的TYR和筛选TYR抑制剂。(2)将TYR的识别基团3-溴甲基苯酚与荧光染料羟甲香豆素通过亲核取代反应,合成了一种用于TYR检测的新型荧光探针。在TYR的催化氧化下,探针的识别基团被氧化为邻苯醌,进而发生裂解反应,脱去识别基团将荧光团释放出来,使得产物的荧光恢复,且荧光强度的增强与TYR活性直接相关。在TYR活性的检测中,具有高灵敏度和宽线性范围的特点,LOD为0.2 U m L~(-1),将其应用于人血清中TYR活性的测定和细胞成像,与标准比色法比较验证了该方法的可行性和实用性。这为生物系统中内源性TYR活性检测提供了一种可行策略。(3)首先以染料亚甲基蓝为荧光团与酪胺反应合成二苯胺型脲键化合物MBOH,进而在POCl_3和H_2O存在下合成含有磷酸基的近红外荧光探针MBP,通过酶级联反应分别检测ALP和TYR的活性。探针MBP的识别基团因含有磷酸基团,荧光被淬灭,而加入ALP和TYR后,发生酶级联反应,ALP可先催化裂解磷酸基团为酚类物质MBOH,进一步在TYR催化下被氧化为邻苯醌,进而脲键水解,脱去识别基团使其在680 nm处荧光恢复,且荧光强度与ALP和TYR活性相关。在最佳条件下,探针MBP对ALP和TYR活性的检测可实现(荧光和比色法)双读数的定量分析,并且具有良好的线性关系、宽线性范围和高灵敏度,对ALP和TYR活性的检测,LOD可分别低至0.005 U L~(-1)和0.005 U m L~(-1)。


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