DNA磷酸化及T4多聚核苷酸激酶的纳米孔单分子检测研究

【摘要】：暴露于环境毒物和压力源、辐射、药物、炎症、细胞呼吸以及常规DNA代谢都会导致细胞毒性DNA链断裂的产生,DNA链断裂后通常缺少DNA合成和DNA连接所需的5'-磷酸和3'-羟基的部分。如果不能解决DNA末端的损伤,会导致DNA复制和修复异常,造成基因组不稳定性、诱变、神经疾病、衰老以及癌的发生。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是生物体内常见的激酶之一,具有5'-激酶和3'-磷酸酶活性。该酶的5'-激酶活性能够催化ATP的γ-磷酸转移到多核苷酸的5'-羟基末端,是修复生物体基因损伤的重要生物酶。传统上多采用放射性同位素~(32)P-标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影测定DNA的磷酸化和T4 PNK活性。这些方法过程繁琐、耗时费力且放射性标记会引起健康问题。近年来,纳米孔单分子技术因其具有免标记、高通量、低成本等优势而迅速成为分析化学领域极具潜力的检测手段。本文以α-溶血素(α-hemolysin,α-HL)蛋白质纳米孔为传感元件,设计使用发夹结构的DNA,实现了DNA磷酸化和T4多聚核苷酸激酶的单分子检测分析。本论文主要研究内容如下:1、文献综述本章简要综述了单分子技术的发展历史、检测原理、纳米孔的分类以及α-溶血素纳米孔在表观遗传物质和单分子酶反应方面的研究进展,并对T4多聚核苷酸激酶的检测方法进行了简述。2、采用α-HL作为传感元件,设计带有发夹结构的DNA,实现对DNA磷酸化的检测。本章我们设计了带有发夹结构的DNA进行磷酸化检测,利用α-HL(WT)_7纳米孔探究了四类未磷酸化和磷酸化DNA的特性。我们发现3'-磷酸化和5'-磷酸化发夹DNA的稳定性远远低于对应的未磷酸化发夹DNA,磷酸化发夹DNA的滞留时间是未磷酸化的十分之一左右。电压及盐浓度变化实验表明5'端或3'端的磷酸与主链上的磷酸酯之间产生的静电排斥作用降低了双链的稳定性,使得其解链时间降低。随着碱基配对数的增加,5'端折叠的发夹DNA(5'-hp DNA)和3'端折叠的发夹DNA(3'-hp DNA)的log(Duration(ms))数值分别呈线性增加且二者的线性直线逐渐接近。通过分析发夹DNA与阿霉素(Dox)结合物的信号发现,阿霉素的加入增强了发夹DNA的稳定性,而且由于5'-磷酸化发夹DNA末端的磷酸根基团与Dox之间的相互作用削弱了磷酸根与主链磷酸基团的静电相斥作用,使得磷酸化的发夹DNA与Dox络合物的稳定性的提高更为明显。因此,利用此体系可以快速检测和分析未磷酸化和磷酸化发夹DNA,并对发夹DNA与药物分子的结合进行研究。相较于其他检测方法,此方法简单、快速、无需放射性标记和纳米孔修饰,该检测方案为检测DNA磷酸化以及分析磷酸化和药物分子对DNA结构的影响提供了新途径。3、采用α-HL作为传感元件,使用发夹DNA作为T4 PNK的底物,实现对T4 PNK激酶活性及其抑制剂的检测分析。基于纳米孔检测分析未磷酸化和5'-磷酸化发夹DNA的结果,本章选用发夹DNA作为T4 PNK激酶的底物,使用α-HL(WT)_7对T4 PNK酶催化反应后的产物进行单分子检测。通过磷酸化前后滞留时间的变化对发夹DNA信号的进一步统计分析,我们发现T4 PNK浓度(0.01～0.10 U/μL)与长滞留时间区域信号所占的比例呈线性负相关,T4PNK的检测限为8.6×10~(-4) U/μL。该方法对许多干扰蛋白无响应,具有较高的选择性,且适用于血清样本的检测,加标回收率为95%～107%。在同一T4 PNK浓度下,T4 PNK活性随着抑制剂(NH_4)_2SO_4浓度的增加而降低,(NH_4)_2SO_4的半抑制浓度为10.5 m M。本方案具有设计简单、检测快速、无需放射性~(32)P标记以及成本较低等优点,灵敏度与准确度较高,其结果为生物体内T4 PNK的相关研究提供了重要参考,是一种具有很大应用潜力的酶检测新手段。