纳米孔单分子检测蛋白质磷酸化与碱性磷酸酶活性

【摘要】：蛋白质磷酸化是生物体内最普遍也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一。磷酸化的鉴定对于阐明复杂的细胞过程和疾病的机制至关重要。蛋白质磷酸化、去磷酸化过程动态可逆,并且在体内发现的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的比例通常很低,在以往的检测过程中磷蛋白常被非磷酸化蛋白的背景信号所掩盖,因此磷酸化蛋白往往不能够得到有效的分析。碱性磷酸酶(ALP)在蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程中发挥着重要的作用,另外其活性水平会影响多种组织器官,是临床诊断中疾病早期筛查的指标。纳米孔单分子技术具有高灵敏性,高选择性,无需标记等优势,且可以在单分子水平上对单个分子进行分析检测。本论文我们利用氨基修饰的β环糊精作为生物纳米孔α-溶血素(αHL)的分子适配器,实现了对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的区分检测以及对ALP活性水平的实时监测。本文主要研究内容如下:1、αHL-(M113R)_7-am_7CD作为传感元件来检测蛋白质的磷酸化本文建立了一种在单分子水平上检测蛋白质磷酸化的方法。我们使用αHL-(M113R)_7-am_7CD作为生物纳米孔传感器,以含有八个氨基酸的寡肽作为模型肽来检测单个位点酪氨酸的磷酸化。研究发现磷酸化肽和未磷酸化肽在阻塞振幅和滞留时间上都存在明显的差异。除此之外,不同位点酪氨酸磷酸化后,肽滞留时间呈现出显著的不同。有趣的是,我们发现磷酸酶对C端和N端磷酸化肽的初始水解速率是中间酪氨酸磷酸化肽水解速率的20倍。我们的研究结果进一步加深了对蛋白质磷酸化机制的理解,对生物基因组学和疾病的探索具有一定的意义。2、单分子水平实时监测碱性磷酸酶活性ALP在脱磷酸化和磷酸化相关的细胞调节和信号传导过程中起着重要的作用。因此,开发高效的ALP活性测定方法对临床诊断具有重要意义。本文建立了一种在单分子水平上基于测定对硝基苯磷酸二钠(PNPP)事件频率来测定ALP活性的方法。该方法具有简单,快捷,无需标记,高灵敏度,高信噪比等优势。我们在0-260 U/L的范围内对ALP活性进行了测定,发现在40-200 U/L的范围内ALP活性和PNPP事件频率呈良好的线性关系,检出限低至0.1 U/L。另外,我们发现大分子拥挤剂会抑制ALP水解而金属镁离子对ALP水解有促进作用。运用本文建立的方法进一步实现了ALP抑制剂的筛选,这对于临床诊断和药物筛选具有重要意义。