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《西北大学》 2019年
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纳米通道单分子技术对DNA和RNA的研究

彭晓  
【摘要】:纳米通道单分子技术是一种高度创新的技术,它广泛应用于DNA测序、疾病诊断、药物筛选、环境监测等领域。作为一种具有实时、灵敏、优异选择性和稳定性等优点的技术,其受到广泛关注。该项技术的原理是在施加电压的情况下,分析物被驱动到纳米孔中,从而产生电流信号,通过分析特征电流信号的持续时间、频率、振幅等信息可以揭示检测物的特性。DNA和RNA是生命遗传物质,科学家们从来没有停止关于DNA和RNA的研究。通过深入了解遗传物质,对生命科学水平的提升具有重大意义。本文包括两部分实验内容,首先是研究单链DNA(ssDNA)在聚乙二醇(PEG)模拟的拥挤环境中穿过α-HL纳米孔的动态过程,其次是在单分子水平上研究前体RNA-21(pre-microRNA-21)和多肽相互作用的机理,主要研究内容具体如下:1文献综述简要综述了纳米孔单分子检测技术的研究发展,检测原理以及该项技术的应用。2拥挤剂诱导DNA穿过纳米孔的研究拥挤的细胞环境与许多重要的生物过程密切相关。然而,分子拥挤效应对DNA穿孔行为的影响研究较少。我们使用纳米孔单分子分析技术来量化PEG存在时ssDNA迁移的热力学和动力学常数。结果表明,ssDNA事件的频率表现出对拥挤剂尺寸大小的非单调依赖性,而ssDNA事件的频率和滞留时间随着拥挤剂浓度的增加而单调增加。在存在PEG的情况下,ssDNA在纳米孔中的迁移速率降低(从20μs/碱基至120μs/碱基),捕获率提高了118.27倍。有趣的是,20%(w/v)PEG 4k对DNA-α-HL纳米孔相互作用的影响最为显着,此时ssDNA的吉布斯自由能和未加PEG环境中的ssDNA相差了16.27 kJ mol~(-1)。PEG 4k浓度为40%(w/v)时,ssDNA-α-HL纳米孔的平衡结合常数增加了764.5倍。该研究为拥挤条件下探索单分子动力学提供了强有力的手段,而且纳米孔分子拥挤效应将在纳米孔生物传感和迫切需要捕获分析物和控制迁移的纳米孔DNA测序中具有广泛的应用。3基于α-HL蛋白纳米通道对pre-microRNA-21和多肽相互作用的研究Pre-microRNA与小分子的相互作用对调控microRNA的水平有重要意义。本实验采用α-HL作为纳米通道,通过对比多肽-pre-microRNA-21复合物和单独的pre-microRNA-21产生的电流响应信号,可以成功观察到多肽-pre-microRNA-21复合物的滞留时间比pre-microRNA-21的滞留时间增加了大概2倍,从419.50±33.29 ms到828.8±61.61 ms,因此结果表明pre-microRNA-21和多肽小分子发生了相互作用,导致pre-microRNA-21的结构更加稳定,解链时间增加。随后将不同摩尔比的多肽和pre-microRNA-21反应产生的复合物加到纳米孔的cis端中,发现随着参加反应的多肽和pre-microRNA-21的摩尔比越大,反应得到的pre-microRNA-21-多肽复合物越多,其在纳米孔中的长滞留时间的事件越多,平均滞留时间越大,当两种反应物固定在某一个摩尔比后,复合物事件的平均滞留时间不再增加,此时多肽和pre-microRNA-21的反应已经达到了饱和。该实验为药物筛选提供了一种新的平台。
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